Rapp. Comm. int. Mer Médit., 37,2004

209

INDUCTION OF P53 IN MUSSEL MYTILUS GALLOPROVINCIALIS TISSUES

Željko Jakšic

Laboratory for Marine Molecular Toxicology, Center for Marine Research Rovinj, Rudjer Boškovic Institute,Giordano Paliage 5, 

HR-52210 Rovinj, Croatia -  jaksic@cim.irb.hr

Abstract

The tumor suppressor phosphoprotein p53 as a biomarker of genotoxic stress in marine mussel Mytilus galloprovincialiswere investigated.

The effect of direct and indirect acting genotoxic xenobiotic compounds on p53 protein family levels were determinated using the Western

blot analysis and immunoassay detection. The well known DNA damaging agents: N-methil-N’-nitro-nitrosoguanidine (MNNG), 4-

nitroquinoline-N-oxide (NQO), and benzo[a]pyrene (B[a]P) induced level of p53 in a time and dose dependent manner. The aim of the

study was to establish the applicability of the p53 induction as a genotoxic stress estimation tool and promised use of p53 as a biomarker

in marine ecotoxicological monitoring research. 

Keywords : biomonitoring, ecotoxicology, genotoxic agents, musell Mytilus galloprovincialis, p53

Introduction

The investigation of tumor suppressor p53 gene and protein family

is in the focus of much interest in last decade. Their sequence,

biochemical properties and biological function were well described

and characterized. Up to date the induction of the p53 protein as an

indicator of genotoxic damage which leads to cell cycle arrest and

DNA repair or apoptosis were investigated in several types of cell

lines. The identification of genotoxic agents effects by p53 induction

has arising interest in last several years (1). 

A few scientific research teams in US showed attention on soft calm

Mya arenariap53 induction. The expression of p53 gene homologue

in this organism(2) and structural and functional data for p53 and p73

gene products (3) were under investigation for a several years. The

clam leukaemia were initially detected and characterized in

hemolymph tumor cells (4). The differential expression of p53 family

members between normal hemocytes and leukaemia cells were

showed by approximately equal amounts of p53 but no p73 is

detectable in normal hemocytes (5.)

Those investigations lead as to make an attempt to establish the p53

induction/level determination, as existing pathway in marine

invertebrates upon genotoxic agents effects, in Mediterranean mussel

Mytilus galloprovincialistissues. In this study the preliminary results

of p53 protein family members induction by chemical xenobiotics are

presented.

Materials and methods

All chemicals were of the highest analytical or molecular biology

grade. Six different Mouse monoclonal antibodies against human p53

and Goat Anti-Mouse IgG, Alkaline Phosphatase conjugate were

purchased by Upstate Biotechnology, USA.

Mussels Mytilus galloprovincialiswere collected in Rovinj area,

Northern Adriatic, and transferred to the laboratory basin, treated with

0-10 g MMNG, NQO and B[a]P /g mussel and incubated in seawater

with ?ow, at 16

-

C. After 2, 6, 12, 24, 48 and 168 hours the mussel

gills and hemolymph were taken from each of the mussel. All the

experiments were performed with 5 mussels in each sample group.

Discontinuous SDS electrophoresis and Western blot were

performed using the BioRad Mini System. Immunochemical

detection of p53 protein levels were performed using polyclonal

rabbit anti-p53 proteins and goat anti rabbit-HRP conjugate.

Western blots were photographed and scanned. Although each

protein lane contained the same amounts of proteins and the

quantization of p53 specific bands was performed by densitometry of

the whole lane areas.

Results and discussion

In present study the induction of the p53 protein family members in

mussel tissues were examinated by using direct and indirect acting

genotoxic xenobiotics.

The effect of 0-10 :g MMNG /g mussel shows a dose dependent

response and highest level of p53 in the first few hours after treatment

of mussels. Mussels injected with the same amount of indirect acting

genotoxic agents: NQO and B[a]P also showed the dose-dependent

p53 induction but the maximum level of protein (increased half-life of

p53 protein) were determinated after several hours of incubation. This

xenobiotic needs biological activation (viaP450 pathway) which

leads to high level of DNA damage and p53 induction. 

This study shows that p53 induction in mussel Mytilus

galloprovincialistissues could be effective tool to identify

environmental genotoxins. The p53 protein family induction/level as

a biomarker in marine invertebrates has a promised role in the

estimation of genotoxic potential in the marine environment. Their

suitability for genotoxicity assessment of pollution impact on aquatic

organisms and environmental monitoring, to predict the

environmental changes upon induced genotoxic effects of mixed

xenobiotics presented in marine environment, has to be under high

interest and further investigation.

References

1-Yang J., and Duerksen-Hughes P., 1998. A new approach to identifying

genotoxic carcinogens: p53 induction as an indicator of genotoxic agents.

Carcinogenesis, 19: 1117-1125.

2-Van Benden J. R., Walker C. W., and Laughner E. S., 1997.

Characterization of gene expression of a p53homologue in the soft-calm

(Mya arenaria). Mol. Mar. Biol. Biotechnol.,6: 116-122. 

3-Kelley M. L., Winge P., Heaney J. D., Stephens R. E., Farell J. H., Van

Benden J. R., Reinisch C. L., Lesser M. P., and Walker C. W., 2001.

Expression of homologues for p53 and p73 in the softshell calm (Mya

arenaria), a naturally-occurring model for human cancer. Oncogene, 20:

748-758.

4-Barker C. M., Calvert R. J., Walker W. C., and Reinisch C. L., 1997.

Detection of mutant p53 in calm leukaemia cells. Exp. Cell Res., 232: 210-

245.

5-Stephens R. E., Walker C. W., Reinisch C. L., 2001. Multiple protein

differences distinguish clam leukaemia cells from normal hemocytes:

evidence from normal hemocytes: evidence for the involvement of p53

homologues.Comp. Biochem. Physiol., 129: 329-338.