COASTAL POLLUTION MONITORING OF SOUTHERN ITALIAN SITES BY THE MUG ASSAY

Caruso G.*, CrisafiE., Mancuso M.

Istituto per l’Ambiente Marino Costiero (IAMC) – Section of Messina, C.N.R., Messina, Italy - * caruso@ist.me.cnr.it

Abstract

A five-year study was carried out on coastal samples collected from Sicilian and Calabrian areas in order to test the performance of an

enzyme approach in comparison with the immuno?uorescence (IF) and standard culture (FC) methods. The MUG assay was found to be

more indicative of the Escherichia colipopulation, as estimated by IF method, than of the whole faecal coliform group determined by plate

counts. The usefulness of MUG assay for monitoring mean and heavily polluted areas is suggested. 

Keywords: Pollution, bacteria, b-glucuronidase, MUG

Rapp. Comm. int. Mer Médit., 37,2004

269

Introduction

The detection and enumeration of Escherichia coliare of

fundamental importance for the control of waterborne diseases and

the assessment of the microbiological quality of bathing waters (1).

Different reasons support the need for rapid enzymatic methods: real-

time assessment would be ideal for the management of water

resources and the protection of public health; current standard

procedures are labour- and time-consuming and unsuitable for

microbiological monitoring; by the incorporation of synthetic enzyme

substrates into culture media, rapid monitoring for specific bacteria

may be performed, avoiding the need for isolation and confirmation

tests (2). The measurement of the 

ß

-glucuronidase activity rate by

using the 4-methylumbelliferyl-

ß

-D-glucuronide (MUG assay) has

been suggested as an indirect alternative approachto estimate the

presence of E. coli(3). In this paper we report a five-years study

carried out on coastal Mediterranean sites, where the reliability of this

method for the monitoring of naturally contaminated samples has

been tested, in comparison with the direct microscopic count by

immuno?uorescence (4) and culture methods.

Materials and methods

The MUG assay relies on the determination of 

ß

-glucuronidase

activity, an enzyme specific of E. coliand Shigellaspp., another

Enterobacterium closely related to E.coli(2). The fluorogenic

compound 4-methylumbelliferyl-

ß

-D-glucuronide (MUG) is the most

suitable substrate for the determination of the 

ß-

glucuronidase

activity; it is enzymatically cleaved into its ?uorescent product, 4-

methylumbelliferone (MU).

For the enzyme assay, the procedure described by Carusoet al. (3)

was followed: 10 ml aliquots of a concentrated sample were added at

increasing MUG concentrations (from 5 to 50 

µ

M, Sigma) and

incubated at 44°C for 3h. Fluorescence intensity measurements were

performed at an excitation of 365 nm and 445 nm emission

wavelength (3). Data were expressed as the maximum rate of

hydrolysis (V

max

) of MUG (in nmol MU released per 100 ml per h),

which provides a measure of the “potential” 

ß

-glucuronidase activity

present in each sample. 

Since 1996, a total of 197 samples were collected from coastal

Sicilian and Calabrian sites and analysed by the MUG assay; faecal

coliform (FC) and E.colicounts were also performed, respectively, by

the membrane filtration method on m-FC agar plates and by the

microscopic ?uorescent antibody (IF) method (4).

Results 

The bacterialcounts obtained on samples analysed showed that

areas examined differed from each other in their pollution levels; the

lowest faecal contamination was measured in Milazzo, followed by

Gioia Tauro and Palermo Gulf, where the average values of faecal

coliforms and E.coliwere less than 2.38x102CFU 100ml-1 and

2.58x104cells 100 ml-1, respectively. The Straits of Messina suffered

a heavier microbial pollution than the other sites; here, FC and E.coli

reached a maximum of 6.13x104CFU and 1.87x105cells 100ml-1. 

ß

-

glucuronidase activity values ranged from 1.30 to 5.57 nmol

MU/100ml/h.

The statistical analysis of the logarithmic-transformed enzymatic

values, plotted versus the immuno?uorescence and plate count

showed that enzyme values correlated with IF values, and therefore

with E.colidensity, more significantly (R

2

=0.1862, n=197, P<0.05)

than with FC values (R

2

=0.1244, n=197, P<0.05). In order to assay

whether the response of the enzymatic assay was affected by the

concentration of faecal coliform bacteria, samples were divided into

different groups according to their FC concentrations. Theregression

analysis showed that at high pollution levels, where FC reached values

over 10

5 

CFU/100ml, the relationship obtained between FC and MUG

wasmore significant (R

2

=0.5774, n=79, P<0.05) than that found

between FC and IF, while at low pollution levels (FC counts less than

10

3

CFU/100ml), a better relationship between FC and IF was

obtained (R

2

=0.1401, n=57, P<0.05), as compared to that between FC

and MUG (R

2

=0.1291, n=57, P<0.05). From 14 to 91% of the

variance in the activity rates depended on the variations in the E.coli

concentration, while a lower percentage (13 to 58%) of the variance

in activity rates was explained by the variations in FC counts. 

Discussion

Results show that the MUG assay represents a practical approach

and can be seen as an alternative to standard culture methods to assess

the microbiological quality of seawaters. It may be applied for early

warning of faecal pollution episodes, making results available quickly

(less than 4 h) and with reduced costs. The highly significant

relationship found between log-transformed MUG and IF values

suggested thathe enzymatic method is more specific for E.colithan for

faecal coliforms.A possible explanation is also that the enzyme

method is able to detect both viable and viable-but non-culturable

(VBNC) cells, still metabolically active, which are estimated by IF

only. This may lead to a more accurate estimate of the actual bacterial

abundance (5). For heavily polluted samples, the enzymatic values

were related more significantly than IF to standard counts, while for

less contaminated samples the statistical relationship between IF and

FC values was more significant than that found between MUG and

FC. We may assume, in fact, that under highly polluted conditions, a

high proportion of cells retained their metabolic activity due to the

high organic matter availability, while in oligotrophic waters the

greater presence of injured/damaged bacteria could account for the

poor relationship between MUG and FC (5). Evaluations of metabolic

activity may sometimes be different from abundance data,

nevertheless the good correlation between the enzyme activity and E.

colivalues supports the determination of 

ß

-glucuronidase activity rate

as an indirect measure of the presence of E.coliand the application of

the MUG assay to the detection of this microorganism in marine

waters. 

Achnowledgements

This study has been funded by the Italian MIUR (Ministry for

University and Scientific Research SAM – Cluster 10 project).

References

1-Bonadonna L., Chiaretti G., Coccia A.M., and Semproni M., 1997.

Valutazione comparativa di procedure analitiche per il rilevamento di

Enterobacteriaceaein acque marine costiere. Rapporti ISTISAN,97/3: 

1-42. 

2-Hartman P.A., 1989. The MUG (Glucuronidase) test for Escherichia

coliin food and water. Pp. 290-308. In:Balows A., Tilton R.C., Turano A.

(eds.) Rapid methods and automation in microbiology and immunology.

Brixia Academic Press, Brescia. 

3-Caruso G., CrisafiE., and Mancuso M., 2002. Development of an

enzyme assay for rapid assessment of Escherichia coliin seawaters. 

J. Appl. Microbiol.,93: 548-556. 

4-Caruso G., Zaccone R., and CrisafiE., 2000. Use of the indirect

immunofluorescence technique for detection and enumeration of

Escherichia coliin seawater samples. Lett. Appl. Microb., 31: 274-278.

5-George I., Petit M., Theate C., and Servais P., 2001. Use of rapid

enzymatic assays to study the distribution of faecal coliforms in the Seine

river (France). Water Sci. Tech., 43: 77-80.