Rapp. Comm. int. Mer Médit., 37,2004
275
SHORTCOMINGS OF CULTURING BACTERIA FROM THE DEEP SEA ANOXIC BASINS
(MEDITERRANEAN SEA)
Laura Giuliano
1*
, Giuseppe D’Auria
1
, Terence J. McGenity
2
, Andrea M. Sass
2
, Daniele Daffonchio
3
, Sara Borin
3
,
Tullio Brusa
3
, Fabienne Morel
4
, Gilles Ravot
5
1
Istituto per l’Ambiente Marino Costiero (IAMC), CNR - Messina, Sp.ta S. Raineri 84 - 98122 Messina, Italy
2
Department of Biological Sciences, University of Essex, Wivenhoe Park, Colchester CO4 3SQ, UK
3
Dipartimento di Scienze e Tecnologie Alimentari e Microbiologiche (DISTAM), via Celoria 2 - 20133 Milano, Italy
4
LMM, CNRS UMR 6117, Centre d’Oceanologie de Marseille Case 907, Campus de Luminy -13 288 Marseille Cedex 9, France
5
Protéus SA, Parc Georges Besse 70, allée Graham Bell 30 000 Nîmes, France
Abstract
Culturing of prokaryotes remains the ultimate goal for a detailed characterization of the metabolic pathways of microorganisms despite
recent advances in genetic analysis of functional genes. We have isolated previously uncultured bacteria from four deep-sea hypersaline
anoxic basins of the eastern Mediterranean Sea. Molecular analysis of isolated bacterial strains point towards a rich bacterial community
present in this extreme environment.
Keywords: bacteria, culturing, deep sea, anoxic basins, Mediterranean Sea
Despite the introduction of culture-independent molecular
screening techniques that allows microbiologists to examine a wide
spectrum of microbial diversity, culturing techniques are still valuable
and might reveal information which cannot be obtained by molecular
techniques (1; 2; 3). The inability to culture bacteria has dampened
efforts to study the links between bacterial taxonomic diversity and
their functional role in the native environment (4; 5; 6; 7). Due to their
non-cultivability, the metabolic potential of the highest number of
described bacterial taxa and, therefore, their possible industrial
application remains unknown. Studying the organisms in culture can
not only provide new information about microbial evolution and
ecology but may also yield a host of useful compounds, such as
antibiotics or enzymes with unexpected properties. 
Within the BIODEEP EU project (EVK3-2000-00042) we have
managed to grow in the lab several strains of previously unculturable
bacteria adapted to thrive at “extreme” conditions—an advance that
may provide a new means of exploring the vast diversity of microbial
species. For such an aim, four deep-sea hypersaline anoxic basins
(DHABs) located in the Eastern Mediterranean Sea have been
sampled at different layers. The DHABs are completely perennially
hypersaline and oxygen-free environments that originate from
ancient subterranean salt deposits (evaporites). Due to their physical
and chemical features, the DHABs could easily represent prime
regions for unraveling the extent of microbial diversity and for
determining the lower limits of life-supporting environmental
parameters. 
About 250 bacteriological samples from the DHAB brines,
interfaces and sediments have been processed with different parallel
technologies and a special attention for reducing the possibility of
contamination. The environmental conditions at the sampling site
were used in media design (e.g. looking for ingredients needed for
the bacteria to survive). About 500 bacterial strains have been
isolated and identified by means of 16S rDNA-based molecular
analysis. The results point towards a rich, mainly high-salt adapted
prokaryotic diversity which may be used as baseline information for
the assessment of microbial communities of other marine
hypersaline anoxic environments. A statistic approach was used for
comparing the used culture media on the basis of the selected
taxonomical diversity and relative abundance. According to that,
several media appeared to be equivalent to each other whereas few
of them were unique. Repeated culturing of the same strain from
more than one DHABs sample supported the hypothesis of the
existence of DHABs adapted cultivable bacteria with similar
metabolic patterns.
The tools described represent state-of–the-art technologies, which
may be among those applied to monitoring life forms in DHABs-like
terrestrial (and extraterrestrial?) environments.
References
1-Leadbetter J.R., 2003. Cultivation of recalcitrant microbes: cells are
alive, well and revealing their secrets in the 21st century laboratory.
Current Opinion in Microbiology,6(3): 274-281. 
2-Rappé M.S., Connon S.A., Vergin K.L., Giovannoni S.J., 2002.
Cultivation of the ubiquitous SAR11 marine bacterioplankton clade.
Nature,418(6898): 630-633.
3-Zengler K., Toledo G., Rappé M., Elkins J., Mathur E.J., Short J.M.,
Keller M., 2002. Cultivating the uncultured. Proceedings of the National
Academy of Sciences,99(24): 15681–15686.
4-Chen F., Binder B., Robert E. Hodson R.E., 2000. Flow cytometric
detection of specific gene expression in prokaryotic cells using in situ RT-
PCR FEMS Microbiology Letters,184(2): 291-296. 
5- Bachoon D.S., , Chen F., Hodson R.E., 2001. RNA recovery and
detection of mRNA by RT-PCR from preserved prokaryotic samples.
FEMS Microbiology Letters,201(2):127-132.
6-Radajewski S., McDonald I.R., Murrell J.C., 2003. Stable-isotope
probing of nucleic acids: a window to the function of uncultured
microorganisms. Current Opinion in Biotechnology,14(3): 296-302. 
7-Wilkinson M.H.F., Schut F., 1998. Quantitative Measurements of
Intestinal Ecology by Digital Image Analysed Microscopy. Bioscience and
Micro?ora, 17 :7-14.