Rapp. Comm. int. Mer Médit., 37,2004

278

RECOVERY OF VIABLE BUT NONCULTURABLE AEROMONAS HYDROPHILACELLS AND 

MAINTENANCE OF ABILITY TO ADHERE TO MCCOY CELLS AFTER RESUSCITATION

S. Maalej

1*

, R. Gdoura

2

and A. Bouain

1

1

Faculté des Sciences de Sfax, Unité de rechercheUR/0907. 3018, Sfax, Tunisia - * sami.maalej@fss.rnu.tn

2

Faculté de Médecine de Sfax, Laboratoire de Microbiologie. Sfax, Tunisia

Abstract

Maintenance of pathogenicity of viable but nonculturable Aeromonas hydrophilacells experimentaly stressed at 5°C in natural seawater

microcosms was investigated. Pathogenicity, in terms of cytotoxicity and ability to adhere to McCoy cells, was lost concomitantly with

culturability, whereas cell viability remained undamaged, as determined by the direct viable count. Recovered cells, by a temperature shift

from 5 to 23°C restore their adhesion properties.

Keywords: Aeromonas hydrophila, VBNC, resuscitation, pathogenicity

Aeromonas hydrophila is an opportunist human pathogen which is

widely distributed in aquatic environments (1,2). A relationship

between changes in water temperature and the incidence of

Aeromonasspp. has been reported. In seawater within arid regions,

aeromonads were found in high numbers in late summer/early autumn

when the temperature was around 20-25°C and were rarely detected

during cold seasons (3). The inability to isolate A. hydrophiladuring

the winter months or from cold waters may result from the entry of

cells into the viable but nonculturable (VBNC) state (4). However,

contreversial results were produced from attempts to restore

culturability. Moreover, in our knowledge, none of the reported

studies adressing the pathogenicity of A. hydrophilanonculturable

and recovered cells. 

In this study, A. hydrophilaATCC 7966 with cytotoxic activity was

used for entering the VBNC state when it was incubated in filtered

sterilized natural seawater. Cells were grown on BHI broth, collected

and immediately suspended in 0.5-liter bottles containing 100 ml of

filter-sterilized natural seawater to obtain a final concentration of 10

8

cfu.ml

-1

and incubated without shaking at 5°C. At fixed times,

samples were collected for culturable, total and Direct Viable

Counting (5). After about 45 days of starvation, when the culturable

cells declined below the detection level of 0.1 cfu.ml

-1

, microcosms

were shifted to room temperature (23°C) without exogenous nutrient

addition. Culturable cells first appeared after one day then increasing

to a maximum of 10

4

cfu. ml

-1

within 3 days of room temperature

incubation. Comparison of the growth rates of the stressed population

and of the untreated bacteria growing in the same autoclaved initial

cell suspension, significantly showed faster growth for the stressed

cells, suggesting that in addition to growth of the few culturable

stressed cells, a given amount of injured cells entered a culturable

state.

In order to test the pathogenicity of culturabe, VBNC, and

recovered cells, attachment ability and cytoxic activity with McCoy

cells were used. Each bacterial suspension was adjusted to 10

6

viable

(i.e. DVC-positive) bacteria and a portion of 300 ?l of a bacterial

suspension was added to the cell monolayer. After 1 h of incubation at

37°C in a 5% CO

2

atmosphere to permit bacterial adhesion, the cells

were stained with Giemsa for 1 mn and visualized by light

microscopy under oil immersion at a magnification of x 100. Our

results showed clearly that entry into the VBNC state was

accompanied by a loss of the adhesion property (Fig. 1A and B). This

loss is transient because, after temperature upshift, the ability to

adhere to McCoy cells was recovered. (Fig. 1C). 

References

1-Janda, J. M. & Abott, S. L. 1998. Evolving concepts regarding the

genus Aeromonas: an expanding panorama of species, disease

presentation, and unanswered questions. Clin. Infect. Dis.,27: 332-344.

2-Schiavano, G., Bruscolini, F., Albano, A. & Brandi, G. 1998. Virulence

factors in Aeromonas spp. and their association with gastrointestinal

disease. New Microbio.,21: 23-28.

3-Maalej, S., Mahjoubi, A., Elazri, C. & Dukan, S. 2003. Simulaneous

effects of environmental factors on motile Aeromonasdynamics in an

urban effluent and in the natural seawater. Water Res.,37: 2865-2874.

4-Wai, S. N., Mizunoe, Y., Takade, A. & Yoshida, S. 2000. A comparison

of solid and liquid media for resuscitation of starvation-and low-

temperature-induced nonculturable cells of Aeromonas hydrophila. Arch.

Microbiol.,173: 307-310.

5-Kogure, K., U. Simidu, and N. Taga. 1979. A tentative direct

microscopic method for counting living marine bacteria. Can. J.

Microbiol., 25: 420.

Fig. 1. Photograph of Aeromonas hydrophila cells in the adhesion assay

with McCoy cells. (A) Adhesion by culturable cells, representing the day

0 sample. (B) Adhesion by VBNC cells collected after 45 days. (C)

Adhesion by recovered cells after 3 days.