Rapp. Comm. int. Mer Médit., 37,2004

280

OCCURRENCE OF CAMPYLOBACTER AND ARCOBACTERSPP. IN SEAWATER 

AND ZOOPLANKTON SPECIMENS

Maugeri T.L.

1*

, Carbone M.

2

, Fera M.T.

2

, Irrera G.P. 

1

and Gugliandolo C.

1

1

Dip. di Biologia Animale ed Ecologia Marina, Salita Sperone 31, Universitŕ di Messina, 98166 Messina

2

Dip. di Patologia e Microbiologia Sperimentale, Via C.Valeria 1, Universitŕ di Messina, 98125 Messina - * tmaugeri@unime.it

Abstract

The presence of Campylobacter andArcobacter spp., bacteria related to human and animal health, as free-living or associated with small

(>64µm) and large plankton (>200µm) was monitored in a coastal zone. The occurrence was evaluated by cultural and molecular methods

during an annual sampling cycle. The bacterial isolation was more frequent from water and large plankton than from small plankton.

Campylobacter concisus was cultured from plankton and seawater samples in April, C. coli and C. lari only from plankton in May 2001.

A multiplex PCR method was useful for the simultaneous detection and identification of Arcobacterbutzleri, A. cryaerophilusand A.

skirrowiion bacterial colonies and on samples without cultivation.

Keywords: free living bacteria, associated zooplankton bacteria.

Current taxonomic status of Campylobacteraceaeincludes three

genera Campylobacter, Arcobacterand Helicobacterthat constitute a

phylogenetically distinct group referred as either ribosomal RNA

superfamily or the epsilon division of the class Proteobacteria. All

genera include human and no human pathogenic species and

widespread forms. Arcobacters differ from other microaerophilic

curved bacteria for their aerotolerance and ability to grow at

temperature lower than 25°C. Four species, A. butzleri, A. skirrowi, A.

cryaerophilusand A. nitrofigilis, have been described, differing for the

ability to grow at 42°C and for the antibiotic sensitivity [1].

At present Arcobacter, as Campylobacter, are considered as

emerging human foodborne pathogens. The survival of these bacteria

in the environment is not well understood. Search on the

campylobacters demonstrated the occurrence of thermophilic

Campylobacterin fresh and marine water, and in the sewage [2]. The

presence of Campylobacteroutside warm-blooded animals, domestic

and wild, is considered as sign of recent contamination because

Campylobactersurvive for a shorter time than the usual faecal

indicators. 

In the framework of a national survey we searched potentially

pathogenic bacteria in water and plankton samples collected from a

coastal station fixed in the Straits of Messina (Italy).

Seawater was monthly collected from April 2001 to March 2002

using sterilised bottles. To collect free-living bacteria, seawater

samples were first filtered through 200 

µ

m net and then through 64

µ

m net, and concentrated using 0.22 

µ

m membrane filters (Millipore

Corp., Bedford, MA). The filters were washed with filter-sterilised,

phosphate-buffered saline (PBS) and used for cultural and molecular

analyses. To collect small plankton (>64 

µ

m), seawater samples

passing through a 200 

µ

m net were successively passed through a 64

µ

m net. The 64 

µ

m net was washed and suspended in PBS. Sample

containing small plankton and associated bacteria was divided in three

aliquots for plankton, cultural and molecular analyses.Large plankton

(>200

µ

m) was collected with a 200 

µ

m mesh plankton net. Retained

large plankton and associated bacteria were suspended in 500 ml

sterile seawater and divided in three aliquots for plankton, cultural and

molecular analyses.

Seawater, small and large plankton were inoculated into tubes of

CampylobacterBroth (BBL). After incubation for 2 days at 42°C a

loop from positive cultures was streaked on Columbia Blood Agar

Base (Karmali) (Oxoid) and incubated at 42°C in microaerobic

atmosphere.

Samples were inoculated into ArcobacterBroth CM965 (AM)

(Oxoid) supplemented with CAT (Cefoperazone, Amphotericin B,

Teicoplanin) Selective Supplement SR 174E (AM174), selective for

Arcobacter species, or with CCDA (Cefoperazone and Amphotericin

B) Selective Supplement SR 155 for Arcobacter butzleri (AM155).

After aerobic incubation at 30°C for 24 hours liquid cultures were

streaked onto plates of the same enrichments media agarised with

1.5% (AMA) [3]. In order to confirm the identification of the isolates

as A. butzleri, A. cryaerophilusand A. skirrowiia multiplex PCR (m-

PCR) assay was performed [4] including ArcobacterbutzleriATCC

49616, A. cryaerophilusATCC 43157 and A. skirrowiiATCC 51132

as reference strains.Five PCR primers, named ARCO, BUTZ, SKIR,

CRY1, and CRY2, based on the 16S rRNA and 23rRNA sequences [4]

were used. The selected primers amplify a 257-bp fragment from A.

cryaerophilus, a 401-bp fragment from A. butzleri and a 641-bp

fragment from A. skirrowii. Amplified products were detected by

electrophoresis in agarose gel. The m-PCR assay was also used for the

detection and differentiation of Arcobacterspp. present in the samples

without cultivation, to detect the “viable but not cultivable (VBNC)”

state. Zooplankton was numerically largest in spring and in late

autumn and mainly consisted of copepods.

Presumptive campylobacters were observed from all samples in

April, but did not in summer when the level of UV radiation and

changes in temperature in?uenced negatively their presence [5].

Campylobacterdoes not always correlate with faecal indicators

given that they become non-culturable much faster than the indicators.

This suggested that wild birds could represent the source of

Campylobacterin our coastal waters rather than the sewage effluent.

In April, species phenotypically identified asC. concisuswere

isolated from both seawater and large plankton samples. In MayC.

coliand C. lariwere isolated only from large plankton but not from

the other samples. 

Presumptive Arcobacter strains obtained from both the enrichments

used (AM174 and AM155 for the isolation of Arcobacterspp. and A.

butzleri, respectively) were almost all identified as A.butzleri. This

species was predominant in seawater samples but was also recovered

from small and large plankton. The enrichment broth AM174

(permissive for A. butzleri) inoculated with seawater and plankton

produced also isolates of A. cryaerophilus, confirmed byPCR.

Molecular assay

was used to identify

A. butzleri, A. cryae-

rophilusand A. skir-

rowidirectly from

samples without cul-

tivation (Fig.1). The-

se results confirm that

Campylobacterand

Arcobac terstrains

are widespread in the

environment. They

indicate recent conta-

mination with animal

(often avian) faeces

or sewage. In the

marine environment,

plankton appear as

potential reservoir of

these bacteria.

References

1-Vandamme, P., Goossens. H. 1992. Taxonomy of Campylobacter,

Arcobacterand Helicobacter: a review. Zentralbl. Bakteriol., 276, 447-472.

2-Jones K. 2001. Campylobacters in water, seawage and the

environment. J. Appl.Microbiol.,90, 68S-79S.

3-Maugeri T.L., Gugliandolo C., Carbone M., Caccamo D., Fera M.T.

2000. Isolation of Arcobacterspp. from a brackish environment.

Microbiologica,23, 143-149.

4-Houf K., Tutenel A., De Zutter L., Van Hoof J., Vandamme P. 2000.

Development of a multiplex PCR assay for the simultaneous detection and

identification of Arcobacter butzleri, Arcobacter cryaerophilusand

Arcobacter skirrowii. FEMS Microbiol. Lett.,193, 89-94.

5-Obiri-Danso K., Jones K. 1999. The effect of a new sewage treatment

plant on faecal indicator numbers, Campylobacters and bathing water

compliance in Morecambe bay. J. Appl .Microbiol.,86, 603- 614.

Fig. 1: m-PCR products amplified from marine

samples and reference strains. 

Lane 1: 100 bp ladder; lanes 2, 3 and 4: seawa-

ter samples; lanes 5, 6 and 7: large plankton;

lanes 8 and 9: small plankton; 10: A. butzleri

ATCC 49616; lane 11: A. cryaerophilusATCC

43157; lane 12: A. skirrowii ATCC 51132.