Rapp. Comm. int. Mer Médit., 37,2004

294

MICROAUTORRADIOGRAPHY AND CATALYZED REPORTER DEPOSITION FLUORESCENCE IN SITU

HYBRIDIZATION (MICRO-CARD-FISH) FOR STRUCTURE-FUNCION ANALYSIS 

OF PROKARYOTES IN DEEP WATERS.

Eva Teira* and Gerhard J. Herndl

Dept. of Biological Oceanography, Royal Netherlands Institute for Sea Research, P.O. Box 59, 1790 AB, Den Burg, The Netherlands

* teira@nioz.nl

Abstract

Only recently, ?uorescence in situ hybridization (FISH) became sufficiently sensitive to allow the enumeration of prokaryotes even in

oligotrophic waters by using catalyzed reporter deposition (CARD-FISH). Penetration of the horseradish peroxidase (HRP)-labeled

oligonucleotide probes into prokaryotic cells needs careful adaptation to the target microoganisms. We refined the CARD-FISH protocol

for detection of marine Archaea substituting lysozyme by proteinase-K as permeabilization treatment. Detection rates of Archaea with

proteinase-K (65±6 % of total DAPI counts) were twice higher than with lysozyme (32±6%). Combining CARD-FISH with

microautoradiography, we determined the uptake of specific organic compounds by the major prokaryotic groups in deep water samples. 

Keywords: FISH, microautoradiography, Bacteria, Archaea, deep ocean.

Introduction

Over the last decade, our knowledge on the richness of marine

prokayotic communities including the deep ocean has increased

considerably through the application of molecular tools as

fingerprinting techniques, cloning and sequencing. An exciting result

derived from the application of these molecular approaches was the

discovery of the widespread presence of archaea in marine plankton

(1, 2). However the assesment of the actual abundance of specific

groups or populations of prokaryotes is more difficult. Basically the

only direct method available is the ?uorescence in situhybridization

(FISH), which yielded very low recovery of Bacteria and Archaea as

compare to nucleic acid-stained in oligotrophic environments.

Only recently, the use of polynucleotide probes allowed the

assessment of the abundance of Archaea in the meso- and

bathypelagic waters of the Pacific (3). Unfourtunately, to tha date, the

use of oligonucleotide FISH has not been succesfully applied in deep

waters. The recently developed Catalyzed Reporter Deposition FISH

(CARD-FISH) for the identification of marine bacteria (4) allows the

use oligonucleotide probes labeled with horseradish peroxidase

(HRP) with great recover efficiency. However, this protocol included

a permeabilisation procedure with lysozyme. Archaeal cell walls do

not contain murein (5), thus, Archaeal cells are not sensitive to

lysozyme. In this study, we modified the CARD-FISH for detection of

marine Archaea substituting the lysozime permeabilization treatment

by proteinase-K treatment and we succefully combined CARD-FISH

with Microautorradiography (MICRO-CARD-FISH) for the detection

of uptake of specific organic compound by deep-water prokaryotic

communities.

Results and discussion

We selected a total of 10 samples from deep waters (100-2750m) of

the North Atlantic Ocean for comparison of permeabilisation

procedures, tus covering a wide range of Archaeal abundance. The

percentages of DAPI counts detected with specific Archaeal probes

(Eury for Euryarchaeota; and Cren for Creanarcaeota) were

considerably higher with proteinase-K than with lysozyme pre-

treatment (Fig 1). The percentage of DAPI cells detected with Eury

probe was 14 ±2% (±SE, n=10) with lysozyme and 30 ±2% (±SE,

n =10) with proteinase K. Similarly, the rate of detection with Cren

probe was 18 ±2% (±SE, n=10) with lysozyme and 35 ±5% (±SE,

n=10) with proteinase-K. Overall, we were able to double our

capacity for Archaeal detection by modifying the permeabilisation

procedure.

We further combined microautorradiography with the refined

CARD-FISH for detection of prokaryotic activity in meso- and

bathypelagic waters. We used tritiated D- and L-Aspatic acid (Asp) as

substrate, and three different probes for the major prokaryote groups:

EUB for bacteria, and the two Archaeal probes described above (Eury

and Cren)(Fig. 2). The percentage of active cells decreased with depth

for the L-Asp both for bacteria and Archaea. However, the D-Asp

showed contrasting uptake patterns between bacteria and Archaea.

Whereas the percentage of active bacteria decreased with depth, the

percentage of active Archaea increased from subsurface waters (100

m) to bathypelagic waters (1000-3000 m). Whereas in subsurface

waters bacteria and Archaea seem to be qually active, in deeper water,

a higher proportion of Archaea is actively taking up D- or L-Asp. 

Fig. 1. Comparison of the detection rates (percentage of probe-

hybridized cells normalized to total DAPI-stained cells) by CARD-FISH for

Crenarchaeota and Euryarchaeota using lysozyme and proteinase-K

treatment for cell wall permeabilization.

Fig. 2. Percentage of Bacteria, Eury- and Crenarchaea taking up D-and L-

Asp normalized to the total number of each group, in different depth

layers of the North Atlantic. Bars represent the mean (±SE) from 10

different stations.

Acknowledgements: this research was funded through a European

Community Marie Curie Fellowship to E.T. and by the Dutch Science

Foundation (NWO-ALW) to G.J.H.

References

1-Fuhrman JA, McCallum K, Davis AA., 1992. Novel Major

archaeobacterial group from marine plankton. Nature, 356:148-149.

2-DeLong EF, Ying Wu K, Prézelin BB, Jovine RVM., 1994. High

abundance of Archaea in Antartic marine picoplankton. Nature, 371: 695-

697.

3-Karner MB, DeLong EF, Karl DM., 2001. Archaeal dominance in te

mesopelagic zone of the Pacific Ocean. Nature: 507-510.

4-Pernthaler A, Pernthaler J, Amann R., 2002. Fluorescence In Situ

Hybridization and Catalyzed Reporter Deposition for the identification of

Marine Bacteria. Appl. Environm. Microbiol., 68: 3094-3101.

5-Kandler O., 1994. Cell wall biocemistry in Archaea and its physical

implications.J. Biol. Phys., 20: 3472-3481.