ASSESSMENT OFCALANUS HELGOLANDICUS EMBRYO 

AND NAUPLIAR MORTALITY USING FLUORESCENT PROBES

Isabella Buttino

1

*, Giovanna Romano

1

, Maristela do Espirito Santo

1,2

, Adrianna Ianora

1

and Antonio Miralto

1

1 

Stazione Zoologica “Anton Dohrn”, Napoli, Italy - * buttino@szn.it

2 

CRIAcq Centro di Ricerca Interdipartimentale per l’acquacoltura, Portici, Napoli, Italy 

Abstract

A diatom diet of Thalassiosira rotula and Skeletonema costatuminduced egg mortality and abnormal development of hatched copepod

Calanus helgolandicusnauplii, depending on the number of ingested cells and the duration of feeding. Here we use ?uorescent techniques

to evaluate copepod embryo mortality following spawning, using the vital probe SYTOX Green, and to assess apoptosis in abnormal

nauplii using the TUNEL enzymatic assay. 

Key-words: Copepod; vital ?uorescent probes; apoptosis

Rapp. Comm. int. Mer Médit., 37,2004

324

In recent years it has been shown that several species of diatoms

produce 

a-ß

unsaturated aldehydes that block embryonic divisions in

various species of invertebrates, including copepods (1-3). The

cellular target of these molecules is still unknown but previous studies

have demonstrated that decadienal, one of the main unsaturated

aldehydes isolated from diatoms, depolymerises microtubules and

actin filaments in sea urchin and tunicate embryos (1;4) and induces

apoptosis in copepod and sea urchin embryos (5). When copepods

feed a diatom diet, egg viability is reduced in a time and concentration

dependent manner (5;6). At lower diatom concentrations, some

embryos develop to hatching but the embryos thus generated are

strongly malformed

(6)

. Here we apply two different ?uorescent

techniques to study the effect of diatom diets on the reproductive

physiology of the copepod Calanus helgolandicus: a protocol to

rapidly calculate embryo mortality soon after spawning, using the

vital ?uorescent probe SYTOX Green (Molecular probes), and an

enzymatic in-situlabeled nucleotide assay (dUTP nick-end labelling,

TUNEL) to evaluate the induction of apoptosis in abnormal nauplii. 

SYTOX Green is a non-permeant nucleic acid stain that enters only

into cells with damaged plasma membranes such as in dead cells that

then appear with green ?uorescent nuclei. Calanus helgolandicus

embryos, produced by females fed the diatom Thalassiosira rotula,

were incubated in chitinase solution (1U/ml for 50 min at 20°C) to

permeabilize the chitinous wall soon after egg spawning. Embryos

were then incubated in SYTOX Green 20 µM for 50 min, and

observed with the epifluorescent or confocal laser scanning

microscope. Egg mortality was determined as the number of

fluorescent as opposed to non-fluorescent embryos. DNA

fragmentation due to apoptosis was detected with the TUNEL kit

(Boheringher GmbH) on abnormal C. helgolandicusnauplii produced

by females fed the diatom Skeletonema costatum. 

Eight days after feeding, percentage egg mortality increased to 75%

when embryos were allowed to develop naturally to hatching (Fig. 1

control). SYTOX Green-treated embryos gave similar results for

embryo mortality (Fig. 1 Sytox + and insert). Figure 2 shows a

deformed nauplius positively stained with TUNEL (arrow) indicating

activation of apoptotic processes in abnormal tissues. Such nauplii die

soon after hatching.

The possibility of applying immuno-?uorescence techniques to

stain embryos and nauplii opens new perspectives in studies on the

reproductive physiology of copepods and zooplankton, allowing for

the rapid assessment (2h) of hatching success and abnormal

embryonic and post-embryonic development compared to other

conventional techniques.

Fig. 2.

References

1-Buttino I., Miralto A., Ianora A., Romano G., Poulet S.A., 1999. Water

soluble extracts of the diatom Thalassiosira rotulainduce aberrations in

embryonic tubulin organisation of the sea urchin Paracentrotus lividus.

Mar. Biol.,134: 147-154. 

2-Miralto A., Barone G., Romano G., Poulet S.A., Ianora A., Russo G.L.,

Buttino I., Mazzarella G., Laabir M., Cabrini M., Giacobbe M.G., 1999.

The insidious effect of diatoms on copepod reproduction. Nature402:

173-176.

3-Pohnert G., 2000. Wound-activated chemical defense in unicellular

planktonic algae. Angew Chem Int Ed., 39:4352- 4354.

4-Tosti E., Romano G., Buttino I., Cuomo A., Ianora A., and Miralto A,

2003. Bioactive aldehydes from diatoms block fertilisation currents in

ascidian oocytes. Mol. Reprod. Dev.66: 72-80.

5-Romano G., Russo G.L., Buttino I., Ianora A., Miralto A., 2003. A

marine diatom-derived aldehyde induces apoptosis in copepod and sea

urchin embryos. J. Exp. Biol. 206: 3487-3494.

6-Poulet S., Laabir M., Ianora A., Miralto A., 1995. Reproductive

response of Calanus helgolandicus. I. Abnormal embryonic and naupliar

development. Mar. Ecol. Prog. Ser.129: 85-95.