A NOVEL METHOD TO DETECT EMBRYO VIABILITY IN THE EGG-CARRYING COPEPOD

CLAUSOCALANUS FURCATUS 

Isabella Buttino *, Àurea Peralba and Maria Grazia Mazzocchi

Stazione Zoologica “Anton Dohrn”, Napoli (I), Italy

Abstract

Copepods of the genus Clausocalanusare among the most abundant calanoids in Mediterranean zooplankton communities. However, the

biology of this genus has been scarcely studied due to difficulties in species identification and rearing. Moreover, most Clausocalanus

species carry the eggs, hindering an estimate of their egg production and viability. In fact, when the sac is separated from the female, eggs

are unable to hatch. In this study we apply a novel method to C. furcatus to detect egg viability using vital ?uorescent probe Fluorescein

diacetate (FDA). 

Key-words: vital ?uorescent probe; confocal microscopy, ?uorescein diacetate

Rapp. Comm. int. Mer Médit., 37,2004

325

Measurements of hatching success and naupliar viability in

planktonic copepods provide important data for understanding

recruitment rates and secondary production at sea (1). These

parameters have also been used to test diet quality and toxic effects of

marine natural products (2). In broadcast spawner copepods, hatching

success can be easily calculated by allowing eggs to develop

undisturbed to hatching (1). In egg-carrying copepods, however, this

protocol is difficult to apply because embryos are not able to hatch

once isolated from females, and total egg production rates can not be

accurately defined. 

In plankton communities over a wide latitudinal range, very

abundant copepods such as Pseudocalanusin the Atlantic Ocean,

Clausocalanusin the Mediterranean Sea, Oithonaand Oncaea in

tropical environments, carry their embryos in sacs or egg masses. 

In this study we analysed the egg viability of an egg-carrying

calanoid copepod using a vital ?uorescent probe Fluorescein diacetate

(FDA) (Sigma-Aldrich). This dye penetrates in viable cells where

esterases produce free ?uorescent ?uorescein and cells appear

?uorescent in green. 

Our target species was Clausocalanus furcatus(Brady, 1883),

which is dominant in the epipelagic zone above the thermocline

during summer in the Mediterranean Sea (3). Clausocalanus furcatus

carry their eggs on the abdomen in a cylindrical mass that is

discharged when the female is disturbed (4). Our method allowed

analysing egg viability without disturbing females, and provided

accurate measurement of egg production. 

Clausocalanus furcatus females were sorted from zooplankton

samples collected in the surface water of the Gulf of Naples (Southern

Italy). They were incubated at 23°C in 2 l jars filled with natural

particle assemblage collected at the sampling site with Niskin bottles.

After 24h, the egg-carrying females were separated in two groups.

One group were incubated in 7.5 µM FDA. After 15 min embryos

were carefully separated from females and observed with the

epi?uorescent or confocal microscopy. The percentage of ?uorescent

embryos is a measure of their viability. Another group of females were

incubated in 300 ml ?ask, left undisturbed until nauplii hatching and

fixed in 4% paraformaldehyde. After settling, nauplii and eggs were

counted under a stereomicroscope, as control. 

Figure 1A shows a C. furcatusfemale carrying the egg mass. After

FDA staining, viable embryos appeared ?uorescent in green (Fig. 1B).

The same embryos hatched soon after observation confirming that

they were viable (Fig. 1C). Some nauplii hatched after the embryos

were removed from females probably because they were separated at

the end of the embryonic development. The percentage of ?uorescent

embryos was 99

±

1.5 sd similar to the controls. In free-spawning

copepods this technique required previous permeabilisation of the

chitinouse wall (5)while in egg-carrying copepods this treatment was

not necessary, indicating that eggs lack hard chitin protection in egg-

carrying species. 

This simple and precise method allows to rapidly detect egg

viability in egg-carrying copepods and could also be used to

investigate other physiological aspects of egg production, such as

remating frequency, or how long embryos must be carried for a

successful hatching. 

References 

1-Ianora A., 1998 Copepod life history traits in subtemperate regions.

J.Marine Syst.,15: 337-349.

2-Miralto A., Guglielmo L., Zagami G., Buttino I., Granata A., Ianora A.,

2003 Inhibition of population growth in the copepods Acartia clausiand

Calanus helgolandicusduring diatom blooms. Mar. Ecol. Prog. Ser.,254:

253-268.

3-Mazzocchi M.G. and Ribera d’Alcalà M. 1995 Recurrent patterns in

zooplankton structure and succession in a variable coastal environment.

ICES Journal Marine Science, 52: 679-691.

4-Mazzocchi M.G. and Paffenhöffer G.A., 1998 First observations on the

biology of Clausocalanusfurcatus(Copepoda, Calanoida). J. Plankton

Res.,20: 331-342.

5-Buttino I., Ianora A., Carotenuto Y., Zupo V. and Miralto A., 2003 Use

of the Confocal Laser Scanning Microscope in studies on the

developmental biology of marine invertebrates. Microsc. Res. Tech.,60:

458-464.