Rapp. Comm. int. Mer Médit., 36,2001

122

Metallothioneins are rather small, metal-inducible and metal-binding pro-

teins that are rich in cysteine residues, and are responsible for the metal

d 

e 

t 

o 

x 

i 

fication and metal homeostasis in living organisms [1,2]. Since the

k 

n 

owledge of the biological functions of MTs, which is based on under-

standing their molecular and physico-chemical properties, is still not com-

plete, our aim was to contribute to this knowledge by characterizing the

metal-binding properties of MT isoforms, induced and isolated from the

d 

i 

g 

e 

s 

t 

ive gland of M. galloprovincialis exposed to cadmium, at a concentra-

tion level close to the cellular one at which metal interacts with the protein.

Experimental

Adult specimens of M. galloprovincialis(5-7 cm, from Lim channel,

Northern Adriatic) were exposed for 14 days to 200 µg Cd dm

-3

(1.8x10

-6

M Cd

2+

added as CdCl

2

) in a continuous ?ow-through seawater system

(S=38‰, 20°C). The biochemical procedure of the isolation and purifica-

tion of MTs from the composite sample of the digestive glands of cadmi-

um-exposedM. galloprovincialisis described elsewhere[ 

3 

, 

4 

].

For further complexation studies the chromatographic fractions which

contained MT were finally selected based on their highest cadmium con-

tent[ 

4 

, 

5 

]. MT content was determined according to the Brdicka reaction

[ 

6 

, 

7 

] 

.Amperometric titrations of MTs with cadmium were performed at

constant temperature (25.0±0.5 °C), ionic strength (0.59 M) and pH

(7.9)[ 

8 

].Voltammetric measurements in a differential pulse anodic strip-

ping mode (DPASV) were carried out with a µAutolab instrument (Eco

Chemie, The Netherlands); the measurement parameters are defined else-

where[ 

8 

].

Results and Discussion

Before commencing the amperometric titration, the cadmium[4 

]. and

metallothionein[ 

7 

]. content was analysed in the selected chromatographic

fractions (Table 1). It was found that dithiotreitol (DTT), added as a reduc-

ing agent during the MT isolation, competes with MT for Cd

2+

ions and

masks CdMT complex formation[ 

6 

].Therefore, DTT must be removed

from the MT samples. Preferably, in the MT isolation procedure ß-mer-

captoethanol should be used instead.

CdMT complexes[ 

9 

, 

1 

0 

]. give the anodic signal (Fig. 1) with the peak

potential at E

p

˜

 -0.66 V.The most positive peak at -0.45 V is assigned to

the oxidation of the mercury electrode in the presence of thiol groups com-

plexed with cadmium[ 

1 

1 

]. (Fig. 1). The fact that during the amperometric

titration of MT with CdCl

2

solution two distinct anodic signals, one of the

CdMT complex and the other of Cd

ionic

(E

p

= -0.60 V; Fig. 1), are observed

indicates that under the selected measuring conditions the CdMT complex

is electrochemically inert and a reversible type of complex. From the peak

heights of CdMT and Cd

ionic

signals using the modified van den Berg-

Ruzic-Lee method

6-8

, the complexing capacity (C

L

) (Table 2), and the

apparent stability constants of CdMT were determined. Normalizing the

available MT concentration for complexing cadmium (C

L

) with the total

(analytical) concentration of metallothionein (c(MT)) the number of cad-

mium ions additionally bound by the MT molecule could be determined.

The variations of the Cd

4

and MT

7

concentrations (Table 1) and the stoi-

chiometric ratio (Table 2) in the selected chromatographic fractions, sug-

gest that different purification procedures caused differences in the metal

and MT content of the chromatographic fractions and therefore resulted in

different complexing properties for cadmium.

Acknowledgments.The financial support of the Ministry of Science and

Technology of the Republic of Croatia, projects No. 00981511 and

No.098431, is gratefully acknowledged.

References

1.Binz P.A and Kägi J.H.R., 1999. Metallotionein: Molecular evolution and classification. In:

Klaasen, C.D. (editor) Metallothionein IV. Birkhäuser Verlag, Basel:7-13.

2.Roesijadi G., 1996. Metallotionein and its role in toxic metal regulation. Comp. Biochem.

Physiol., 113C: 117-123.

3.Pavicic J., Skreblin M., Raspor B., Branica M., Tusek-Znidaric M., Kregar I. and Stegnar P.,

1987. Metal pollution assessment of the marine environment by determination of metal-binding

proteins in Mytilus galloprovincialis. Mar. Chem., 22: 235-248.

4.Juric D., 1998. Cadmium-induced synthesis of metallothionein isoforms in the digestive gland

of the mussel Mytilus galloprovinsialis. M.Sc. Thesis, University of Zagreb, pp. 88 (in Croatian). 

5.Raspor B., Kozar S., Pavicic J. and Juric D., 1998. Determination of the cadmium and copper

content inherent to metallothionein. Fresenius J.Anal. Chem., 361:197-200.

6.Erk M. and Raspor B., 2000. Advantages and disadvantages of voltammetric method in studying

cadmium-metallothionein interactions. Cell. Mol. Biol., 46: 269-281.

7.Erk M., 2000. Study of chemical reactivity of metallothioneins using electrochemical

techniques. Ph.D.Thesis, University of Zagreb, pp. 107 (in Croatian).

8.Erk M. and Raspor B., 1998. Evaluation of cadmium-metallothionein stability constants based

on voltammetric measurements. Anal. Chim. Acta, 360: 189-194.

9.Raspor B and Pavicic J., 1996. Electrochemical methods for quantification and characterization

of metallotioneins induced in Mytilus galloprovincialis. Fresenius J.Anal. Chem., 354: 529-534.

10.Erk M. and Raspor B., 1999. Electrochemical study on Cd binding to metallotioneins isolated

from the mussel, Mytilus galloprovincialis. J. Electroanal. Chem., 466: 75-81.

11.Mendieta J., Chivot J., Muñoz A. and RodrÌguez A.R., 1995. Electrochemical behavior of

metallothioneins and related molecules. Part I: Lys-Cys-Thr-Cys-Cys-Ala thionein fragment [56-

61] MT I. Electroanalysis,7: 663-669.

PHYSICO-CHEMICAL STUDY OF CADMIUM-METALLOTHIONEIN COMPLEXES ISOLATED FROM

CADMIUM EXPOSED MUSSELS (MYTILUS GALLOPROVINCIALIS)

Marijana Erk*, Dusica Juric, Sonja Kozar, Jasenka Pavicic and Biserka Raspor

Rudjer Boskovic Institute, Center for Marine and Environmental Research, Zagreb, Croatia

Abstract

The amperometric titrations of the purified metallothionein (MT) chromatographic fractions with cadmium ions were performed in the

buffered 0.59 M NaCl solution, pH 7.9 at 25°C. MTs were isolated from digestive glands of the mussels (Mytilus galloprovincialis)

exposed to cadmium. Different purification procedures of the chromatographic fractions could be the reason for the differences in their

metal and MT content. It is perhaps the reason for their different complexing properties for cadmium. The applied differential pulse anodic

stripping voltammetry (DPASV) is suitable for physico-chemical characterization of MTs due to its species-selectivity and sensitivity.

Key words: cadmium, complexation, metallothionein, Mytilus galloprovincialis

Purified

chromatographic

c

(Cd) / M

c

(MT) / M

fractions

MT10(IV)

7.54·10

-8

1.5·10

-6

MT10(V)

5.05·10

-8

3.3·10

-6

MT10(27)

4.34·10

-7

2.1·10

-7

MT20(18)

5.34·10

-7

1.1·10

-7

MT10(12)(13)E.P.

1.08·10

-6

not determined

Purified

chromatographic

c

(MT)* / M

C

L

/ M

C

L

/

c

(MT)

fractions

MT10(IV)

4.0·10

- 9

4.0·10

- 9

1.0

MT10(V)

8.0·10

- 9

1.0·10

-8

1.3

MT10(27)

5.8·10

-10

1.0·10

-9

1.7

MT20(18)

4.3·10

-10

5.7·10

-10

1.3

MT10(12)(13)E.P.1.3·10

- 8

7.0·10

-9

0.5

MT20(17)(18)E.P.4.2·10

- 9

1.4·10

-8

3.3

* aliquot of c(MT) from Table 1 diluted in 20 ml supporting electrolyte

Table 1.Cadmium and MT content in the selected chromatographic frac-

tions

Figure 1 Amperometric titration of MT in 0.59 M NaCl, pH 7.9 with cad-

mium: to 50 µl MT10(IV)(or 4·10

-9

M) Cd

2+

solution is added in the con-

centration range from 1.42·10

-9

M to 8.52·10

-9

M

10

.

Table 2.Cadmium complexing capacity (CL) of MT from differently puri-

fied chromatographic fractions. The results refer to 0.59 M NaCl, pH 7.9