Rapp. Comm. int. Mer Médit., 36,2001

169

Introduction

The development of “clean” techniques has led to a sharp increase in

studies on the geochemistry of trace metals and their roles as limiting nutri-

ents for oceanic primary production. These studies require the use of bulk

size-fractionation techniques to isolate organisms or particles from their

surrounding liquid medium for analysis. Typically, whole water is collect-

ed and filtered either serially or in parallel through 0.2, 2.0 and 20 µm

membrane filters to divide the particles into the corresponding biological

size classes of pico-, nano-, and microplankton (1). The filters are then

rinsed and analyzed for metal content. This approach can only provide

information about the metal contents of the trapped particles in aggregate.

In situations where there is a mixed assemblage of microbial organisms (as

is usually the case in natural waters), this "bulk chemistry" technique can-

not distinguish metal concentrations in different organisms of the same

size or between living and abiotic particles. Additionally, heterogeneity

among cells of the same species is not assessed, as all of the particles in a

certain size class are grouped together for analysis.

Materials and methods

We have attempted to overcome the limitation of bulk- chemistry metal

analysis through the use of a high-brilliance synchrotron x-ray ?uores-

cence microprobe at the Advanced Photon Source (APS) at Argonne

National Laboratory.This instrument uses highly-focused x-rays to induce

?uorescence in metal atoms within individual plankton cells (2). Natural

plankton samples are mounted on EM grids, and individual cells of inter-

est are identified either through light or epi?uorescence microscopy.The

grids are then mounted in the x-ray microprobe and the same cells identi-

fied and characterized by light microscopy are targeted and scanned with

the x-ray beam. The optics of the x-ray beam can be adjusted to increase

photon ?ux (increasing sensitivity) or to reduce the area of the beam

(increasing resolution). At each pixel in the two dimensional scan, the ele-

ments present in the sample are excited by the incident x-ray beam and

emit ?uorescent photons at characteristic energies, producing a ?uores-

cence spectra for each pixel detected by germanium lithium detectors. The

?uorescence intensity is quantified and converted to metal concentration

through the use of standards. The technique is similar to energy-dispersive

x-ray ?uorescence used to quantify elements in macrophyte algae (3).

Without the brilliant x-rays provided by the synchrotron, however, this

technique lacks the sensitivity to measure metals in single-celled plankton

samples. New third-generation synchrotrons such as the APS provide the

necessary x-ray intensity.Additionally, advances in x-ray optics have

reduced the size of the incident x-ray beam, increasing the resolution of the

instrument to 0.2 µm (or 0.04 µm

2

). The microprobe has the sensitivity to

quantify and map Si, Ca, K, Fe, Cu, and Zn (and potentially Cr, Mn, Ni,

As, and Se) in individual planktonic particles. The high resolution allows

us to quantify element concentrations in different particles and to map the

distribution of metals within single particles. We have used this novel tech-

nique to quantify elemental concentrations in several different classes of

nanoplankton collected off the coast of Southampton, NY. In order to pre-

sent the results as cellular concentrations, cellular metal contents were nor-

malized to biomass by assuming a squashed ellipsoidal cell shape in com-

bination with published estimates of C:volume ratio for each type of cell

(4-6) and assuming C:dry weight conversions of 3 for ciliates and ?agel-

lates and 4 for diatoms. We examined two oligotrichous Strombidium-like

ciliates 15 µm in diameter, 6 large Thalassiosira-like centric diatoms (25

µm diameter), and 5 small autotrophic ?agellates (6 µm diameter).

Results and discussion

The measured concentrations of K, Ca, Fe, Cu, and Zn in ciliates,

diatoms and ?agellates are shown in Table 1. We included K and Ca in our

results as possible indicators of cellular biomass. These are the first report-

ed results, to our knowledge, of metal concentrations in individual phyto-

plankton and protozoa cells. All of the samples were collected from the

same site and the ciliate and diatom cells appear to be of the same genus,

respectively.Although these results are based on a small sample size, they

suggest that there is considerable variation in the metal concentrations of

similar cells from the same location as well as between the different cell

types. The diatoms show the highest metal concentrations of all the cells,

and the ?agellates have significantly lower concentrations than the two

groups of larger cells. The concentrations of Fe, Cu, and Zn in the ciliates

and ?agellates are within the range of values reported for plankton from

bulk chemical measurements taken during a diatom bloom off Monterey,

CA (7), but the diatoms in the present study have Fe and Cu concentrations

that are 135% and 231% higher, respectively. Our results might be expect-

ed to be higher since the other study included all plankton-sized particles,

including detritus that may have had lower metal concentrations.

This technique also shows promise as a tool for studying the internal

distribution of metals within individual plankton cells. Fig. 1 shows the

distributions of 6 elements in one of the diatom cells. The elemental con-

centrations vary spatially: Si is primarily found in the exterior test of the

cell; Cl, Ca, and Zn are more common in the organic biomass of the cell,

as shown by their density in the two frustules of the cell; Fe appears to be

highly localized in the upper frustule.

References

1.Twiss M.R. and Campbell P.G.C., 1998. Scavenging of 

137

Cs,

109

Cd, 65Zn,

and 153Gd by plankton of the microbial food web in pelagic Lake Erie sur-

face waters. J. Great Lakes Res., 24: 776-790.

2. Sparks C.J., 1980. X-ray ?uorescence microprobe for chemical analysis, pp.

459-512In:Winick, H. and Doniach S. (eds.), Synchrotron radiation research,

Plenum Press, NewYork.

3. Carvalho M.L, Ferreira J.G., Amorim P., Marques M.I.M. and Ramos M.T.,

1997. Study of heavy metals and other elements in macrophyte algae using

energy-dispersive x-ray ?uorescence. Environ. Toxicol. Chem., 16: 807-812.

4. Hansen P.J., Bjornsen P.K. and Hansen B.W., 1997. Zooplankton grazing

and growth: scaling within the 2-2,000 um body size range. Limnol.

Oceanogr., 42: 687- 704.

5. Borsheim K.Y. and Bratbak G., 1987. Cell volume to cell carbon conver-

sion factors for a bactivorousMonassp. enriched from seawater.Mar.Ecol.

Prog. Ser., 36: 171-175.

6. Strathmann R.R., 1967. Estimating the organic carbon content of phy 

to-

plankton from cell volume or plasma volume. Limnol. Oceanog 

r., 12: 411-418.

7. Martin J.H. and Knauer G.A., 1973. The elemental composition of plank-

ton.Geochim.Cosmochim. Acta, 37: 1639-1653.

MEASUREMENT OF ELEMENT CONCENTRATIONS IN MARINE NANOPLANKTON CELLS 

USING AN X- RAY FLUORESCENCE MICROPROBE

Benjamin S. Twining,* Stephen B. Baines, and Nicholas S. Fisher

Marine Sciences Research Center, State University of NewYork, Stony Brook, USA - btwining@ic.sunysb.edu

Abstract:

A novel technique is described for the quantification and localization of trace elements in marine nanoplankton that utilizes brilliant syn-

chrotron x-rays to excite ?uorescence. Thirteen individual cells, including ciliates, diatoms, and autotrophic ?agellates collected off the

coast of NewYork were analyzed for K, Ca, Fe, Cu, and Zn. There was considerable variability in trace metal concentrations both within

and among taxa from a single site. This technique for studying the distribution of elements within single cells may provide a unique under-

standing of metal-biota interactions.

key words: synchrotron; metals; plankton

Table 1. Concentrations of five metals in marine ciliates (n = 2 cells

examined), diatoms (n = 6 cells), and ?agellqates (n = 5 cells). Mean val-

ues (µg g-1 dry wt) and standard deviations (SD) are given.

ElementCiliatesSDDiatomsSDFlagellatesSD

(n=3)

(n=6)

(n=5)

K16,78120,85735,75921,5331,546934

Ca8,2642,77219,77216,5272,3971,413

Fe4241178095758740

Cu33714069318388111

Zn10602951343722

Fig. 1: The first image (right) is a light micrograph of a diatom.

The other six images show the distribution of Si, Cl, K, Ca, Fe,

and Zn within the same cell, based on x-ray ?uorescence.