Rapp. Comm. int. Mer Médit., 36,2001

179

BIOMONITORING OF TOXIC , CARCINOGENIC POLLUTANTS BY MOLECULAR AND BIOCHEMICAL

RESPONSES OF FISH CYTOCHROME P4501A1 (CYP1A1) ALONG THE IZMIR BAY

ON THE MEDITERRANEAN SEA

Emel Arinç*, Semra Kocabiyik, Alaattin Sen and Erkan Su

Middle East Technical University, Department of Biology,Ankara,Turkey - earinc@metu.edu.tr

Abstract

In this report we present biomonitoring of toxic carcinogenic organic compounds by using induction of CYP1A1 mRNA, protein and

7 

-ethoxyresorufin O-deethylase (EROD) activity as biomarkers in liver of leaping mullet (Lisa saliens) caught along the Izmir Bay.

Pasaport containing the highest concentrations of petroleum hydrocarbons (12.45µg/L) and the other sites (sites 2,3,4,and 11) showed

significantly increased EROD activity and CYP1A1 protein level as compared to the values from uncontaminated (<1µg/L) reference site,

Foca. These conclusions were further confirmed with the results of fish liver CYP1A1 mRNA level measurements.

Key words: Pollution, Biomonitoring, Enzymes, CYP1A1, PCB, PAHs, Carcinogens.

Introduction

With the recent advances in molecular biology and biochemistry,

responses of fish and other organisms to pollutants are used for the

ecological impact assessment of these compounds in the aquatic envi-

ronment to detect both the early and long term effects and to examine

also their possible genotoxicity.The best characterized and used bio-

chemical marker so far is the induction of CYP1A in fish liver (1,2).

O 

rganic pollutants such as dioxins, dibenzofurans, polyaromatic

hydrocarbons (PAH), polychlorinated biphenyls (PCBs), specifically

induce liver CYP1A in fish and in other vertebrates. CYP1A mostly

converts certain classes of PAH procarcinogens and other organic

chemicals to their carcinogenic metabolites by forming epoxides or

other oxygenated compounds. Thus, induction of CYP1A is used to

measure both exposure and resulting toxic, carcinogenic effects of

these types of organic pollutants.

Izmir Bay is located on the Aegean Sea of the Mediterranean, west

ofTurkey. Domestic and industrial wastes, urban, agricultural run off,

discharges from ships, sediments and contaminated waters of rivers

heavily pollute the Bay (3). Although, the contamination of Bay with

the heavy metals has been monitored since 1960s, both the degree and

specific sites of pollution by the organic carcinogenic compounds and

the biological effects of monitoring in the Bay have remained unex-

plored until recently (4).

We have carried out biomonitoring studies by using CYP1A1

dependent enzyme activity induction in leaping mullet (Lisa saliens)

and in common sole (Selea vulgaris) liver measuring 7-ethoxyre-

sorufin O-deethylase (EROD) activity, CYP1A1 protein amount by

western blotting on the several sites in Izmir Bay since 1995. In the

most recent studies, the degree of the increased liver CYP1A1 mRNA

level of leaping mullet was added to our monitoring studies. In this

communication, biomonitoring of toxic carcinogenic organic com-

pounds by using these three parameters, that is, induction of CYP1A1

mRNA, protein and EROD activity in fish liver will be presented.

Sequence analysis of cDNA cloned from liver of leaping mullet col-

lected from site 1, Pasaport demonstrated that it is CYP1A1 (Sen et

al., unpublished. GenBank Accession Number AF072899).

Sampling sites and fish :

The collection sites, all were in Izmir Bay, are given in Fig.1.

Leaping mullets, each weighing 300-400 g, were caught by fish net.

Methods

Preparation of microsomes, determination of protein and EROD

activity were described elsewhere in detail(4). Cytochrome P4501A1

protein levels were determined by Western blot analysis using poly-

clonal antibodies (anti-mullet CYP1A1) produced in our laboratory

against purified leaping mullet CYP1A1 as described before (4).

Total cellular RNA was isolated from the liver tissue of leaping mul-

lets collected from different stations essentially as described before

(6). Following the electrophoresis and transfer of RNA samples,

Northern blot hybridization was accomplished by using the synthetic

new 33-mer oligonucleotide probe designed for this purpose, 5’-dCTC

ATC CAG CTT CCT GCT CTC GCA GTG ATC AAT-3’. Details of

the procedure are given elsewhere in detail (6).The results are subject-

ed to Student’s t-test for the statistical analysis.

Results and Discussion

The results of .biomonitoring studies carried out in January 1999

are given in Fig. 1. EROD activities of leaping mullet from site 1

(Pasaport) in the inner Bay showed highly elevated enzyme activities

(1028 ± 287 pmol/min/mg, n=4) which were 93 times higher than the

value at reference site 2 (site 8 on the Fig. 1). Leaping mullets caught

from site site 6 and site 11 showed moderately elevated EROD activi-

ties that were 105± 26 (n=4) and 310± 21 (n=4) pmol/min/mg protein,

respectively. In our first monitoring studies carried out in 1995 and

1996 using leaping mullet liver CYP1A1 enzyme activity, EROD,

similar results were obtained

The leaping mullet from the highly urbanized and industrial section

of the Bay, Pasaport (site1) showed highly elevated enzyme activities

(1293± 292 pmol/min/mg protein, n=208), which were about 62 times

higher than the value at the reference site 1, (site 10 in Fig. 1). (25 ± 9

pmol/min/mg protein, n=4).Leaping mullet caught along a pollutant

gradient at three other sites, Karsiyaka (site 2), Inciralti (site 3), and

Tuzla (site 4), also had highly elevated EROD activities, as can be seen

in Fig. 1 (4).

In both biomonitoring studies (1996 vs. 1999), leaping mullet sam-

pled from site1, Pasaport containing the highest concentrations of

petroleum hydrocarbons (12.45 µg/L) showed the highest liver EROD

activity. In addition, these livers had highest CYP1A1 protein levels as

determined by Western blotting. Next to site1, mullet captured from

site 2 and site 3 also had very high EROD activities and a good corre-

lation was obtained between the EROD activity and CYP1A1 protein

content measured immunochemically as shown in Fig. 2A.

Thus, these molecular and biochemical indices, highly induced

EROD activities, CYP1A1mRNA and protein levels in the liver of

leaping mullet caught from sites 1,2,3 and 4 suggests that these sites

are highly contaminated with carcinogenic PAHs and / or PCBs and

possibly other toxic compounds.

The results obtained from CYP1A1 protein and EROD activity were

further supported by CYP1A1 mRNA studies of leaping mullet. As

seen in Fig. 2B, RNA isolated from the liver of mullet collected from

the most polluted site revealed considerably strong hybridization sig-

nal whereas only a weak hybridization signal was detected with liver

RNA of fish caught from reference point, site10 

This results also suggest that CYP1A1 gene expression is transcrip-

tionally induced by chemical pollutants in the contaminated sites. T 

h 

u 

s 

,

these molecular and biochemical indices, i.e., highly induced ERO 

D

a 

c 

t 

ivities, CYP1A1mRNA and protein levels in the liver of leaping

Figure 1. EROD activities of liver microsomes of common sole

(Solea vulgaris), leaping mullet (Liza saliens) and gray mullet

(Mugil caphalus) captured in Izmir Bay at ten different sampling

sites.

The activity bars with “a” represent the field studies carried out in