183

In-situPCR is a modification of PCR in which the amplification and

the detection of specific target nucleic acid sequences are carried out

inside intact cells rather than on extracted nucleic acid. The detection

of the amplification signal is performed by ?uorescent i 

n 

- 

s 

i 

t 

u

hybridization (FISH). In line of principle, individual genes, mRNA,

and rRNA are all candidate targets for this technique. In this way

genetic abilities and their expression, and taxonomic information are

all potentially accessible on the individual cell level. This approach

has been used successfully in eukaryotic cells, whereas very little is

know about the possibility to amplify DNA or RNA sequences in

whole prokaryotic cells. The application of this approach to microbial

ecology should enable the in-situanalysis of gene content in bacteria,

also including the tracking of conjugative plasmids or transposable

elements. Cells might also be analyzed in their natural or experimen-

tal environment, as in the case of complex microbial communities (1).

Up to now, few data are reported regarding this issue, and concern

withEscherichia coliandPseudomonascells (1, 2, 3), but, in line of

principle, this methodology could be applied to every (micro) organ-

ism. Therefore, this approach could be extremely useful for the analy-

sis of natural microbial communities isolated from polluted areas.

In this study, we present the set up i 

n 

- 

s 

i 

t 

uPCR for the detection of

A. venetianusVE-C3 cells. This bacterium has been isolated, as a com-

ponent of a microbial community, from polluted seawater of Ve 

n 

i 

c 

e

Lagoon (5). It has been previously demonstrated that this strain is able

to perform efficient oxidation of diesel-fuel (5), opening the possibili-

ty of its use as a biosensor. Therefore, the availability of a technique

enabling the measurement of the distribution of this bacterium in pol-

luted environments, and also the expression of genes invo 

l 

ved in

b 

i 

o 

d 

egradation of n- 

hydrocarbons would be of great importance.

The following experiments were carried out on pure cultures of

A.venetianusVE-C3 and E. coliXl1-blue cells. Cells of the two bac-

terial strains, cultured in LB medium, were fixed in 4% paraformalde-

hyde; cell wall permeabilization was then achieved by the use of

lisozyme. PCR was performed on whole cells by using two primers

allowing the amplification of nearly the entire 16S rDNA. During

PCR, the amplified sequences were also labelled with digoxigenin11-

dUTP. Samples were then spotted on slides and incubated with a

hybridization solution containing alkaline phosphatase - labelled anti-

DIG antibodies conjugate with FITC. Slides were analyzed under a

?uorescence microscope and the target cells labelled with FITC were

visualized under blue-green light excitation (488 nm). Results are

shown in figures 1 and 2; data obtained showed the successful ampli-

fication of 16S rDNA in whole A. venetianuscells (Fig. 1), whereas no

?uorescent signal was found in the control experiment (Fig. 2). The

same results were obtained with E. coliXl1-blue cells (not shown).

In order to check the possibility of using other target sequences for

in-situ- amplification, we choose the A. venetianus gyrBsequence

(encoding the b-subunit of DNA gyrase) as target in the further exper-

iments. For this purpose, the VE-C3 gyBsequence was firstly ampli-

fiedviaPCR by using the primers previously described by Yamamoto

et al (4). The amplification product was cloned, and its nucleotide

sequence determined.

Two oligonucleotides were then designed on this sequence and used

as primers in in-situPCR experiments on whole A. venetianusVE-C3

cells. Data obtained (not reported) revealed the amplification of the

gyrBsequence inside the A. venetianuscells.

This body of data suggested that in-situ PCR can be successfully

used to amplify DNA sequences within Acinetobatercells and might

represent a powerful tool for identification and monitoring of this bac-

terium in microbial communities.

References

1. Jacobs D, Ales ML, Goodman AE and Neilan BA (1997). Improved

methods for in-situenzymatic amplification and detection of low copy

number genes in bacteria. FEMS Microbiol. Letters, 152: 65-73.

2. Hodson RE, Dustman WA, Garg RP and Moran MA (1995). In-situ

PCR for visualization of microscale distribution of specific genes and

gene products in prokaryotic communities. Appl. Environ. Microbiol., 61:

4075-4082.

3. Chen F, Gonzales JM, Dustman WA, Moran MA and Hodson RE

(1997).In-situreverse trascription, an approach to charaterize genetic

diversity and activities of Prokaryotes. Appl. Environ. Microbiol., 63:

4907-4913.

4.Yamamoto S, Bouvet PJM and Harayama S (1999). Phylogenetic

structures of genus Acinetobacterbased on gyrBsequences: comparison

with the grouping by DNA-DNA hybridization. International Journal of

Systematic Bacteriol., 49 87-95.

5. Di Cello F, Pepi M, Baldi F and Fani R (1997). Molecular

characterization of an n-alkane degrading bacterial community and

identification of a new species, Acinetobacter venetianus. Res.

Microbiol., 148: 237-249.

Rapp. Comm. int. Mer Médit., 36,2001

IN SITUPCR AMPLIFICATION OF 16SRDNAANDGYRBGENE IN ACINETOBACTER VENETIANUSCELLS

M. Betti

1

, F.Torricelli

2

, S. Bonifacio

2

, F. Baldi

3

, M. Pepi

3

and R. Fani

1

*

1

Dipartimento di biologia animale e genetica, Università degli Studi, Firenze, Italy

2

Citogenetica e genetica U.O., A.O. Careggi, Firenze, Italy

3

Dipartimento di Scienze ambientali, Venezia, Italy - r_fani@dbag.unifi.it

Abstract

Thein-situpolymerase chain reaction (in-situPCR) is a molecular technique combining the extreme sensitivity of the PCR with the in-

situhybridization.In-situPCR is used to detect very low quantities of DNA in intact cells. We present a protocol, which has been used to

amplify the 16S rDNA and the gyrBgene in Escherichia coliand inAcinetobacter venetianuscells. The latter has been isolated from the

Venice Lagoon and is able to perform the efficient oxidation of n-hydrocarbons and could be used for bioremediation purposes in polluted

areas.

Keywords: in-situ PCR, Acinetobacter venetianus, Escherichia coli, FISH.

Fig. 1. In-situPCR amplification of 16S rDNAsequence in VE-

C3Acinetobacter venetianusfixed cells. 

Fig. 2.In-situPCR control reactions.