186

Rapp. Comm. int. Mer Médit., 36,2001

Introduction

Microbial hydrolysis of natural polymers through extracellular

enzymes is considered a fundamental step in the degradation of the

organic matter in both pelagic and benthic environments (1). Enzyme

activities are known to be highly sensitive to environmental changes

and respond differently to the organic matter supply (2, 3). Microbial

abundance and metabolic activities may undergo substantial alter-

ations, i.e. such as in intensive aquaculture farms (4) or in mariculture

sites (5). 

In the framework of a multidisciplinary research program aimed at

evaluating the impact of fish-farming plants on the environment, extra-

cellular enzyme activities and heterotrophic bacterial abundance were

studied in order to evaluate changes in their distribution induced by

mariculture activities. The preliminary data, reported here, outline a

preliminary picture of the metabolic potentialities of bacterial com-

munities present in natural undisturbed conditions, before the begin-

ning of fish-farming experiments.

Material and methods

Surface water (0.5m) and sediment (0-1.5cm) samples were collect-

ed from two areas located along the Tyrrhenian coast, Castellammare

Gulf (A) and Capo d’Orlando (B), in both spring and summer (area A:

late March and June 2000; area B: May and July 2000). A third area,

Portopalo of Menfi(C), in the Mediterranean Sea, was sampled only

in summer (July 2000). Three extracellular enzymes (leucine

aminopeptidase, LAP, b-glucosidase, glu, and phosphatase, phos),

involved in the hydrolysis of proteins, mucopolysaccharides and

organic phosphates respectively, were estimated using specific ?uoro-

genic substrates (L-leucine-7-amido-4-methylcoumarin, 4-methylum-

belliferyl(MUF)

ß

-D-glucopyranoside and MUF-phosphate) (2, 6).

Measurements were performed after 3 hours at the in situtemperature

in a TD-700 Turner ?uorimeter, at 380/440 excitation/emission wave-

lengths, for LAP, and at 365/455 for glucosidase and phosphatase.

Enzyme levels in sediments were also normalised to grams of dry

weight. Bacterial heterotrophic density was evaluated on Marine agar

2216 (Difco) plates incubated at 22°C for 7 days. A three-way Anova

test (F-test) (areas X months X stations) was used to assess statistical

significance of variations in the variables measured. 

Results

The mean values of enzyme levels measured in water samples

showed a strong variability from site to site; bacterial density values

were more homogeneous (range 1.4-1.9x10

3

CFU/ml). In area A,

aminopeptidase (68.4±7.9-541.3±9.1nM/h/l in spring and summer

respectively) and phosphatase (9.2±1.8-99.3±1.7nM/h/l in the two

sampling periods) predominated; glucosidase was detected only at low

concentrations (3.6±1.7-17.0±5.1nM/l/h in spring and summer respec-

tively). Area B displayed high phosphatase and glucosidase (peak

value 91.8±6.5nM/h/l) values. In Area C phosphatase levels reached

their maximum (1.8±0.3µM/h/l). Within each area temporal variations

were also observed, mainly in summer for LAP and phosphatase val-

ues in area A. 

In sediments, the mean values of enzyme activities were 2-3 orders

of magnitude higher than those reported for water. Phosphatase activ-

ity prevailed over the other enzymes in the three sampled areas (range

1.5±0.05-98.1±0.1µM/l/h). High aminopeptidase levels were also

recorded in areas C (16.8±1.6µM/l/h) and B (14.6±3.2µM/h/l). This

latter was characterised by the highest values (4.9±0.3µM/l/h) of glu-

cosidase activity. Enzyme activities, in particular phosphatase, were

consistently higher in summer. Bacterial densities were on average one

order of magnitude higher than in waters (range 7.8x10

3

-

2.9x10

4

CFU/ml).

The ANOVA test of data showed highly statistical significant differ-

ences, due to the variables “areas”, “months” and “stations”, for phos-

phatase (F=7.77, 4.61, 15.48 respectively) and density (F=8.44, 9.72,

8.91 respectively) data. In sediments, variations in glucosidase and

density levels were ascribable to variable “stations” (F = 4.63 and

4.70, respectively). Pearson’s correlation coefficients revealed signifi-

cant (P<0.05) relations between aminopeptidase and glucosidase only

in summer in the waters of area A (r=0.84) and C (r=0.99) and in the

sediments of area C (r=0.98). Significant relationships between bacte-

rial abundance and both LAP and phos (r=0.99, P<0.05) were evi-

denced in summer in the sediments of area B only.

Discussion

Enzyme values obtained in this study are the first available in the

areas examined and may add some useful information to knowledge of

the metabolic capabilities of microorganisms involved in organic mat-

ter decomposition. This preliminary study points out how the distribu-

tion of bacterial abundance and enzyme activities in water and in sed-

iments did not follow a clear pattern; changes in activity levels were

apparently independent from changes in bacterial abundance. The

summer increase in heterotrophic bacterial concentration is probably a

consequence of higher temperature and of a seasonal nutrient supply

both in water and sediment. The occurrence of enzyme activity in sur-

face sediments with remarkably higher values than in water suggests

the high catabolic potentiality of heterotrophic bacteria and a faster

organic matter turnover due to the presence of a higher fraction of

active bacterial cells (7). Further studies carried out at intermediate

and final step of the establishment of productive activities will allow

to follow the course of metabolic processes and verify it or identify

microbial functional alterations related to mariculture activity. In par-

ticular, heterotrophic bacterial communities present in marine sedi-

ments, able to respond to short term environmental changes more

rapidly than those present in water column (8), could potentially be

used as early warning indicators of environmental disturbance.

References

1. Azam F., Smith D.C., Steward G.F., Hagstrom A., 1993. Bacteria-

organic matter coupling and its significance for carbon cycling. Microb.

Ecol., 28: 167-179.

2. Manini E., Danovaro R., Fabiano M., 1999. Early diagenesis of

sedimentation and bacterial response in a frontal system of the Adriatic

Sea: preliminary results. A.I.O.L., Atti, 13(1): 271-279.

3. Caruso G. and Zaccone R., 2000. Estimates of leucine aminopeptidase

activity in different marine and brackish environments. J.Appl.

Microbiol., 89: 951-959. 

4. Bedwell M.S. and Goulder R., 1996. Bacterial outputs from ponds and

tanks used in intensive fish farming. Lett. Appl. Microbiol., 23: 412-416.

5. La Rosa T., Mirto S., Danovaro R., Fabiano M., Manganaro A.,

MaugeriT., Mazzola A., 2000. Meiofauna and benthic microbial biomass

in relation to organic matter content in a strong biodepositional system.

Biol. Mar. Medit., 7(1): 239-246. 

6. Hoppe H.G., 1993. Use of ?uorogenic model substrates for

extracellular enzyme activity (EEA) measurement of bacteria. In: Kemp

P.F., Sherr B.F., Sherr E.B., Cole J.J. (eds.), Handbook of methods in

aquatic microbial ecology. Lewis Publishers, Boca Raton, pp.423-431. 

7. Boetius A. and Lochte K., 1999. Extracellular enzyme activity in

marine sediments. 1st Workshop on “Enzymes in the environment:

activity, ecology and applications”, Granada, Spain, 12-15 July, p.114.

8. Danovaro R., Dell’Anno A., Mei M.L., 2000. Benthic bacterial

response to putative pollution gradients along the Apulian coasts.

Seminario Progetto INTERREG II Italia/Grecia, Genova, 21 novembre,

p.9.

EXTRACELLULAR ENZYMATIC ACTIVITIES IN WATER AND SEDIMENT: FIRST EVALUATION IN

THREE SITES DESIGNATED FOR MARICULTURE

Caruso G.

Istituto Sperimentale Talassografico, C.N.R., Messina, Italy - caruso@ist.me.cnr.it

Abstract

Extracellular enzymatic activities (leucine aminopeptidase, 

ß

-glucosidase and phosphatase) and heterotrophic bacterial density were

investigated both in water and sediment samples of three marine sites of the Mediterranean Sea, in order to point out any variations related

to mariculture activity.The preliminary data obtained before the beginning of fish farming experiments showed significant variation

patterns among the sites for all the parameters examined even in undisturbed conditions. 

Key-words: enzymes, bacteria, aquaculture