190

Twenty-five bacterial strains isolated from Venice Lagoon and able to

degraden-alkanes,n-alkanols,n-alkanals and n-alkanoates, were previ-

ously characterized at the molecular and physiological level (1, 2). Only

strains belonging to the new species A. venetianusgrew in minimal medi-

um containing n-alkanes (C

10

, C

14

, and C

20

) (2) and their respective oxi-

dation products as the sole carbon and energy source. The other strains

thrived on n-alkane oxidation products, giving rise to a sort of "functional

complementation", in that single members of the community perform dif-

ferent step(s) of the degradation process. The A. venetianusVE-C3 cells

initiate diesel fuel degradation by oxidizing n-alkanes, providing organic

residues suitable for the other bacteria of the community.

The analysis of plasmid content revealed that A. venetianusVE-C3 cells

harboured two plasmid molecules, pAV1 and pAV2, of 10Kb and 15Kb,

respectively. Hybridization experiments also showed that pAV2 contained

sequences homologous to the Pseudomonas oleovoransalkBFGH genes.

TheA. venetianusVE-C3 cells were able to degrade diesel fuel by a

mechanism requiring the formation of cell aggregates and their further

adhesion to diesel fuel drops, via the synthesis of a polysaccharide capsule

(3). This process was studied in A. venetianusmutants, obtained through

the conjugal transfer of pRK290, a 20 kb broad-host range plasmid, from

Escherichia colito VE-C312 (a spontaneous Rif

r

mutant) cells. Most of ex-

conjugants showed large rearrangements in plasmid profile, mainly con-

sisting in loss of plasmid pAV1 (such as in mutant C312/3); other mutants

showed a molecular rearrangement of this plasmid (mutant C312/30).

Mutants C312/3 and C312/30 were further characterized at physiological

and molecular level; they showed a reduced ability to grow in the presence

of diesel fuel or hexadecane as the sole carbon and energy source. This was

probably due to a reduced ability of aggregation and the further adhesion

to hydrocarbons, as shown in figure 1. Moreover in cell-to-surface adhe-

sion experiments, performed by MATH test, VE-C3 and VE-C312 cells

appeared to be hydrophilic when grown in a complex medium but became

hydrophobic when incubated in mineral medium with diesel fuel as the

sole carbon and energy source (not shown). The same test, carried out on

mutants C312/3 and C312/30, showed that both of them were always

hydrophobic, even when grown in a complex medium without diesel. The

mutant phenotype could be due to the loss (or mutation) of genes (very

likely located on plasmid pAV1) encoding proteins involved in cell to cell

aggregation and that might be localized on cell envelope.To check this

hypothesis, membrane proteins were extracted from VE-C3 cells grown in

the complex medium and in the mineral medium with diesel fuel as sole

carbon and energy source. PAGE analysis of these proteins showed the

presence of a 23.8 KDa protein only in A. venetianus VE-C3 cells grown

in the presence of diesel fuel. This protein was absent in cell extracts of

VE-C3 cells grown in the absence of hydrocarbons. The 23.8 KDa protein

is induced by hydrocarbons and is probably involved in adhesion of bacte-

ria to hydrocarbons. Studies are in progress in order to understand the role

of the protein in the cell adhesion to hydrocarbon process.

The study of hydrocarbon degradation in A. venetiuanus VE-C3 was

also carried out by cloning of alk genes. For this purpose polymerase chain

reaction (PCR) experiments were carried out in order to amplify alk

sequences from both VE-C3 chromosome and plasmids. PCR reactions

were performed using two primers previously designed for the amplifica-

tion of alk sequences from different microorganisms.We obtained the

amplification of a 600-bp DNA fragment from the VE-C3 chromosome,

whose nucleotide sequence was determined. The comparative analysis of

this sequence with those available in databases revealed that it shared a

high degree of sequence similarity with alkM genes from different hydro-

carbon-degrading bacteria. This suggested that, at least some genes

involved in diesel fuel degradation in A. venetianus are located on the bac-

terial chromosome. Studies of this gene, as well as the nucleotide sequenc-

ing of plasmids pAV1 and pAV2, are in progress.

References

1. Baldi F, Pepi M, Fani R, Di Cello F, Da Ros L and Fossato VU (1997).

Complementary degradation of n-paraffins by aerobic Gram-negative

bacteria isolated from Venice Lagoon. Croatica Chemica Acta, 70(1):

333-346.

2. Di Cello F, Pepi M, Baldi F and Fani R (1997) Molecular

characterization of an n-alkanre degrading bacterial community.Research

in Microbiology, 148: 237-249.

3. Baldi F, Ivosevic N, Minacci A, Pepi M, Fani R, Svetlicic V and Zutic

V(1998) Adhesion of encapsulated Acinetobacter venetianusto fuel-oil

droplets studied by in situelectrochemical and molecular probes. Appl

Environ Microbiol, 65(5): 2041-2048.

Rapp. Comm. int. Mer Médit., 36,2001

DIESEL FUEL DEGRADATION  : PHYSIOLOGICAL AND MOLECULAR CHARACTERIZATON OF

ACINETOBACTER VENETIANUS STRAINS ISOLATED FROM VENICE LAGOON

S. Grazzini

1

, L. Cioni

1

, M. Innocenti

1

, R. Cecchi

1

, F. Baldi

2

, M. Pepi

2

and R. Fani

1

*

1

Dipartimento di biologia animale e genetica, Università degli Studi, Firenze, Italy - r_fani@dbag. unifi.it

2

Dipartimento di Scienze ambientali, Venezia, Italy 

Abstract

The bacterial strain VE-C3, belonging to the new species Acinetobacter venetianus, isolated from Venice Lagoon and involved in diesel

fuel degradation, was characterized by a combination of molecular and physiological techniques. A. venetianusVE-C3 cells were able to

grow in the presence of n-hydrocarbons by forming cell aggregates which adhere to hydrocarbon drops. A 23.8 KDa protein appeared to

be involved in the formation of cell aggregates. The oxidation of n-hydrocarbons was carried out by Alk proteins homologous to the

Pseudomonas oleovorans alkBFGH gene products and whose genes were located on the VE-C3 chromosome and in plasmid pAV2.

Keywords: diesel fuel, Acinetobacter venetianus, alk genes

Figure 1. Analysis of cell aggregation of A. venetianusstrains

grown on diesel fuel (A-D) or on n-hexadecane (E-H). (A, E) A.

venetianusVE-C3; (B, F) A. venetianusC312; (C, G) A. vene-

tianusC312/3; (D, H) A. venetianus C312/30.