Rapp. Comm. int. Mer Médit., 36,2001

191

Three carbonate crust samples collected from distant mud volca-

noes in the eastern Mediterranean were used in a multidisciplinary

study to gain insight in the processes that lead to carbonate crust for-

mation and the role of anaerobic methane oxidation in these process-

es. The combination of lipid biomarker analysis and microbial com-

munity structure studies based on analyses of 16s rRNA gene

sequences identified a highly diverse methane-consuming archaeal

community composed mostly of novel species.The results obtained,

suggest that the ability to oxidise methane under anoxic conditions by

archaea may be phylogenetically more widespread within the Archaea

than previously suggested. 

Methane is an important greenhouse gas and recent geologic and

glacial studies have shown its potential impact on climate change (1).

As a consequence, controls on methane production and consumption

are important considerations in the discussion on climate change.

Authigenic carbonate crusts are sinks for methane carbon originating

from depth or shallow gas hydrates (2,3). Understanding their forma-

tion by anaerobic methane oxidation is important in assessing  the con-

tribution of ocean-atmosphere carbon exchanges to global warming. 

In the eastern Mediterranean, seven mud volcanoes (1600 and 2000

m depth) were explored with the Nautilesubmersible during the

Medinaut cruise of the R/V Nadirin 1998. Their central parts active-

ly seep methane to the bottom waters and are covered by thick car-

bonate crust pavements (4). In a multidisciplinary study, three carbon-

ate crust samples from distant mud volcanoes (MN16BT2, MN14BT3

and MN12BT4, respectively) were used to study the processes that

lead to carbonate crust formation and to detect microbes involved in

anaerobic methane oxidation. Special emphasis was placed on the pos-

sible role of anaerobic microorganisms in this process. To this end the

microbial community structure was analysed (16S rRNA studies) and

results were combined with lipid biomarker analysis and compound-

specific carbon isotope measurements.

Analyses of cellular lipid biomarkers showed the presence of

diverse and novel isoprenoidal alkyl diethers, tetraethers and irregular

isoprenoids that are diagnostic of archaea (5,6) in crusts MN16BT2

and MN13BT4, whereas MN14BT3 showed little abundance of such

markers. These compounds were strongly depleted in 

13

C (-101‰ <

?

13C < -69‰) indicating assimilation, rather than production, of 

13

C-

depleted methane by Archaea (7). In addition, lipid biomarkers indica-

tive for sulphate reducing bacteria (SRB) were detected in all three

crusts. These SRB biomarkers were also depleted in 

13

C . These low

?

13

C-values of cellular lipid biomarkers and the co-occurrence of SRB

with Archaea are consistent with the hypothesis that anaerobic

methane oxidation is carried out by consortia of these prokaryotes

(8,9).

DNA appeared to be present in large amounts in the crusts.

Analyses of the microbial community structure based on 16S rDNA

sequences showed the presence of bacterial and archaeal communities

in crusts MN16BT2 and MN13BT4. In crust MN14BT3 16S rDNA of

members of an archaeal community were not detected. All three crusts

showed little similarity between the bacterial communities. These bac-

terial communities consisted of phylogenetically diverse organisms,

most of which appear to be novel species. Based on 16S rDNA analy-

sis, only crust MN16BT2 showed the presence of organisms related to

sulphate reducing bacteria (

?

-proteobacteria).

Analysis of the archaeal community of crust MN16BT2 revealed

the presence of three archaeal clusters, two of which appear to be relat-

ed to Archaea previously identified in cold seep sediments (10). One

of these two clusters has been suggested to be involved in anaerobic

methane oxidation (10). The third cluster comprised novel, previously

undetected archaeal sequences. In crust MN13BT4, two clades, con-

sisting of ten new archaeal species comprising several lineages were

identified. All these clusters in crust MN13BT4 are distinct from those

of crust MN16BT2 and have not been previously reported for any set-

ting.

The combination of lipid biomarker analysis and microbial com-

munity structure studies indicated the presence of a highly diverse

methane-consuming archaeal community composed of mostly novel

species. The occurence of anaerobic methane oxidation by archaeal

communities both in the absence and presence of SRB may suggest

that the ability to anaerobically oxidise methane may be phylogeneti-

cally more widespread within the Archaea than previously suggested.

References

1-. Petit, J.R., Jouzel, J., Raynaud, D., Barkov, N.I., Barnola, J.-M,

Basile, I., Bender, M., Chappellaz, J., Davis, M., Delaygue, G., Delmotte,

M., Kotlyakov,V.M., Legrand, M., Lipenkov,V.Y., Lorius, C., Pépin, L.,

Ritz, C., Saltzman E., and M. Stievenard, 1999. Climate and atmospheric

history of the past 420,000 years from the Vostok ice core, Antarctica.

Nature,399, 429-436.

2-. Ritger, S., Carson, B. and E. Suess, 1987. Methane-derived authigenic

carbonates formed by subduction-induced pore-water expulsion along the

Oregon/Washington margin. Geol. Soc. Am. Bull., 98, 147-156.

3-. Bohrmann, G., Greinert, J., Suess, E. and M Torres, 1998. Authigenic

carbonates from the Cascadia subduction zone and their relation to gas

hydrate stability.Geology,26, 647-650 .

4.-M

EDINAUT

/M

EDINETH

Shipboard Scientific Parties, 2000. Linking 

Mediterranean brine pools and mud volcanism. EOSTransactions,

American Geophysical Union, 81, 625-632.

5-. Kates, M., 1993. pp.261-295. In: Kates, M., Kushner, D.J. and

Matheson, A.T eds., The biochemistry of Archaea (Archaeabacteria).

Elsevier Science, NewYork.

6-. Hopmans, E.C, Schouten, S., Pancost, R.D., van der Meer, M.T.J. and

J. Sinninghe Damsté, 2000. Analysis of intact tetraether lipids in archaeal

cell material and sediments by high performance liquid

chromatography/atmospheric pressure chemical ionization mass

spectrometry.Rapid Communications in Mass Spectrometry,14, 1-5.

7-. Pancost, R.D., Sinninghe Damsté, J.S., de Lint, S., van der Maarel,

M.J.E.C., Gottschal, J.C. and MEDINAUTShipboard Scientific Party,

2000. Biomarker evidence for widespread anaerobic methane oxidation

in Mediterranean sediments by a consortium of methanogenic archaea

and bacteria. Appl. Environ. Microbiol., 66, 1126-1132.

8-. Hoehler,T.M., Alperin, M.J., Albert, D.B., and C.S.  Martens, 1994.

Field and laboratory studies of methane oxidation in an anoxic marine

sediment: Evidence for a methanogen-sulfate reducer consortium. Glob.

Biogeochem. Cycle,s8, 451-463. 

9-. Boetius, A., Ravenschlag, K, Schubert, C.J., Rickert, D., Widdel, F.,

Gieseke, A., Amann, R., Jorgensen, B.B., Witte,  U., and O. Pfannkuche,

2000. A marine microbial consortium apparently mediating anaerobic

oxidation of methane. Nature,407, 623-626.

10-. Hinrichs, K.-U., Hayes, J.M., Sylva, S.P., Brewer, P.G., and E.F.

DeLong, 1999. Methane-consuming archaebacteria in marine sediments.

Nature,398, 802-805.

# J. L. Charlou, J. P. Donval, A. Fiala-Medioni, J.-P. Foucher,

R. Haese, P. Henry, G. de Lange, J. Mascle, G. Nobbe, H. Pelle, 

M. Sibuet, M. J. E. C. van der Maarel, J. M. Woodside

Rapp. Comm. int. Mer Médit., 36,2001

MICROBIAL COMMUNITY STRUCTURE OF DEEP SEA CARBONATE CRUSTS: 

NOVEL ARCHAEA INVOLVED IN ANAEROBIC METHANE OXIDATION ?

Sander K. Heijs

1

*, Giovanni Aloisi

2

, Ioanna Bouloubassi

3

, Larry.J. Forney

4

, Richard D. Pancost

5

, Catherine Pierre

2

,

Jaap S. Sinninghe Damsté

6

, Jan C. Gottschal

1

and the M

EDINAUT

shipboard scientific party

#

1

University of Groningen, Department of Microbiology, Center of Ecological and Evolutionary Studies, AA Haren, The Netherlands

s.k.heijs@biol.rug.nl

2

Laboratoire d’Océanographie Dynamique et de Climatologie, Université Pierre et Marie Curie, Paris, France.

3

Laboratoire de Physique et Chimie Marines, Université Pierre et Marie Curie, Paris, France

4

Department of Biological Sciences, University of Idaho, USA 

5

O 

rganic Geochemistry Unit, School of Geochemistry, University of Bristol, 

6

Netherlands Institute for Sea Research, Department of Marine Biogeochemistry and To 

x 

i 

c 

o 

l 

o 

g 

y, AB Den Burg (Texel), The Netherlands

Keywords: Eastern Mediterranean, carbonate crust, bacteria, deep sea ecology