197
Around Eolian Islands many marine hydrothermal systems are from
shallow to a depth of 800 m, with temperature values from 25 to 95 °C and
rich in dissolved gases (CO
2
, CH
4
, H
2
, and H
2
S). From these sites, a wide
variety of Eubacteria and Archea have been described re?ecting the very
varied physical and chemical conditions around the shallow thermal vents
(1-7). In the framework of the European project (MAST III-95-0034) titled
"Microorganisms in deep sea vents and marine hot springs as sources of
potentially valuable chemicals", studies on bacterial diversity at hydrother-
mal system of Eolian Islands have been undertaken by direct and cultural
techniques (8). Here we report the isolation of novel prokaryotes and their
cultural, biochemical and genetic characteristics.
Materials and methods 
The enrichment of aerobic, heterotrophic, thermophilic bacteria was
obtained from water samples filtered through membrane filters. Filters
were inoculated into Bacto Marine Broth 2216 (Difco) and liquid Medium
D (9). The media were incubated at 65°C for three days in aerobic condi-
tions. Isolation was made on the same media supplemented with agar (2%).
Optimal growth was tested after incubation at different temperatures
(range 37 - 75 °C), pH (5.5 – 9.0) and salt concentration (0 - 10%). Bio-
chemical properties were screened (8). Genetic characterization was car-
ried out according to Sunna et al.(10).
Results and discussion 
Eighty-seven thermophilic bacilli were isolated from water and sedi-
ment samples collected close to the vents (11). Numerical analysis of their
phenetic characteristics showed a high diversity in respect to thermophilic
reference strains (8). Also the restriction patterns of their amplified 16S
rDNA were different from those of reference strains. Eighteen representa-
tive strains from groups of isolates having identical patterns were selected
for subsequent analyses. Genetic characterization of the selected isolates
demonstrated the novelty of six of them. In fact, comparison of their 16S
rDNA sequences with those of reference Bacillusspp. gave similarity val-
ues in a range of 93-99.1%. Phylogenetic analysis indicated the position of
most of isolates within the radiation of the BacillusrRNA group 5 includ-
ing thermophilic strains. DNA-DNA reassociation studies yielded less than
70% homology between these six isolates and the phylogenetically closest
species, finally allowing their classification as novel thermophilic Bacillus
species. One of them, strain 3s-1, has been already described as Bacillus
vulcani DSM 13174
T
(12).Table 1 shows the chemo-taxonomic properties
of the six novel species in comparison with thermophilic type strains of
BacillusrRNA group 5. Strain 3s-1, strain 4-1, and strain 1bw were isolat-
ed from Vulcano, strain 7S from Panarea, strain 5-2 from Lipari, and strain
10-1 from Stromboli. The new species had optimal growth at 55-60 °C and
neutral pH, with NaCl 2%, since of their marine origin. They were adhe-
sive on substrate as polystyrene and were able to produce exopolysaccha-
rides. All were resistant to heavy metals such as cadmium and zinc, and
some of them also to mercury, silver and arsenic. They are indeed interest-
ing for biotechnological applications as other thermophilic Bacillusspp.
yet described (13).
References
1. Stetter K.O., Konig H. and Stackebrandt E., 1983. Pyrodictiumgen. nov., a new
genus of submarine disc-shaped sulphur reducing archaebacteria growing optimally
at 105°C. System. Appl. Microbiol., 4: 535-551.
2. Stetter K.O., Lauerer G., Thomm M. and Neuner A., 1987. Isolation of extremely
thermophilic sulfate reducers: evidence for a novel branch of archaebacteria.
Science,236: 822-824.
3. Fiala G. and Stetter K.O., 1986. Pyrococcus furiosussp.nov. represents a novel
genus of marine heterotrophic archaebacteria growing optimally at 100 °C. Arch.
Microbiol., 145: 56-61.
4. Huber H. and Stetter K., 1989. Thiobacillus prosperussp. nov., represents a new
group of halotolerant metal-mobilizing bacteria isolated from a marine geothermal
field.Arch. Microbiol., 151: 479-485. 
5. Gugliandolo C. and Maugeri T.L., 1993. Chemolithotrophic, sulfur-oxidizing
bacteria from a marine, shallow hydrothermal vent of Vulcano (Italy).
Geomicrobiol.J., 11: 109-120. 
6. Keller M., Braun F.J., Dirmeier R., Hafenbrandl D., Burggraf S., Rachel R. and
Stetter K.O., 1995. Termococcus alcaliphilussp. nov., a new hyperthermophilic
archaeum growing on polysulfide at alkaline pH. Arch. Microbiol., 164: 390-395. 
7. Hafenbradl D., Keller M., Dirmeier R., Rachel R., Rossnagel P., Burggraf S.,
Huber H. and Stetter K.O., 1996. Ferroglobus placidusgen. nov., a novel
hyperthermophilic archaeum that oxidizes Fe2+ at neutral pH under anoxic
conditions.Arch. Microbiol., 166: 308-314.
8. Maugeri T.L., Gugliandolo C. and Caccamo D., 2000. Biodiversity of
thermophilic bacilli isolated from shallow marine vents of Eolian Islands, Italy.
pp.45-47.In: CIESM Workshop Series2, Investigating marine microbial loops: new
tools and perspectives. Monaco.
9. Degryse E., Glansdorff N. and Pièrard A.A., 1978. Comparative analysis of
extreme thermophilic bacteria belonging to the genus Thermus. Arch. Microbiol.,
117: 189-196.
10. Sunna A., Tokajian S., Burghardt J., Rainey F., Antranikian G. and Hashwa F.,
1997. Identification of Bacillus kaustophilus, Bacillus thermocatenulatusand
Bacillusstrain HSR as members of Bacillus thermoleovorans.System. Appl.
Microbiol., 20: 232-
237.
11. Gugliandolo C., Italiano
F., Maugeri T.L., Inguaggiato
S., Caccamo D. and Amend
J.P., 1999. Submarine
hydrothermal vents of the
Aeolian Islands: Relationship
between microbial
communities and thermal
?uids.Geomicrobiol. J., 16:
105-117.
12. Caccamo D., Gugliandolo
C., Stackebrandt E. and
MaugeriT.L., 2000. Bacillus
vulcanisp. nov., a novel
thermophilic species isolated
from a shallow marine
hydrothermal vent. Int. J. Syst.
Evol. Microbiol., 50: 2009-
2012.
13. Nicolaus B., Panico A.,
Manca M.C., Lama L.,
Gambacorta A., Maugeri T.L.,
Gugliandolo C. and Caccamo
D., 2000. A thermophilic
Bacillusisolated from an
Eolian shallow hydrothermal
vent, able to produce
exopolysaccharides.System.
Appl. Microbiol., 23: 426-432.
Table 1. Phenotypic characteristics of the new thermophilic isolates and taxonomically related reference strains
Characteristics
B. thermo
-
B. stearo
-
B. thermo
-strain 3s-1
Bacillus
sp.
Bacillus
sp.
Bacillus
sp.
Bacillus
sp.
Bacillus
sp.
denitrificansthermophilus
l
eovoransB. vulcani
strain 4-1strain 1bwstrain 7sstrain 5-2strain 10-
1
DSM 465
T
DSM 22
T
DSM 5366
T
DSM13174
T
G+C mol (%)50.352.651-565340.8453943.242.7
Growth at 37 °C-
+
-
++-
+
--
Growth at 70 °C+
+
+
+-+
-
++
Growth at pH 5.5+
-
-
+--
-
--
Growth at pH 9-
-
-
+++
+
-+
NaCl (0%)+
+
+
+--
-
++
NaCl (3%)+
+
-
+++
+
++
Nitrate reduction+
+
+
+--
-
-+
Denitrification+
-
v
ndndndndndnd
Anaerobic growth+
w
v
-ndndndndnd
Hydrolysis of :
starch
+
+
+
+++
-
-+
casein
w
+
w
-+-
-
++
Utilization of:
citrate
-
-
v
-++
-
--
Production of:
acetoin
-
+
-
-++
-
+-
Acid from:
glucose
+
+
+
+-+
-
++
sucrose
+
+
+
+-+
+
++
mannose+
+
+
+-+
-
++
Rapp. Comm. int. Mer Médit., 36,2001
ISOLATION OF SIX NOVEL SPECIES OF THERMOPHILIC BACILLI FROM SHALLOW MARINE VENTS
MaugeriT.L.*, Caccamo D., Gugliandolo C.
Dipart. di Biologia Animale ed Ecologia Marina, Sez. Ecologia Microbica e Biotecnologie, Univ. di Messina, Italy - tmaugeri@unime.it
Abstract
Six aerobic thermophilic bacilli, capable of growing at 65°C, were isolated from water and sediment samples collected at shallow
hydrothermal vents of Vulcano, Lipari, Panarea and Stromboli islands of Eolian Archipelago (Italy). On the basis of physiological and
genetic characteristics, these isolates were demonstrated to be different from other well described reference species of the genus Bacillus
and were classified as novel species. 
Key -words: bacteria, biodiversity, thermal vents